熊進　何順榮　吳鑫穎　邱樹毅　簡輝　馬威

摘要：采用高效液相色譜測定黑曲霉B0201制備的沒食子酸，對底物添加方式、底物濃度、轉(zhuǎn)化方式及轉(zhuǎn)化條件等因素進行研究。最終確定較佳工藝條件為：用五倍子直接作為產(chǎn)酶的誘導(dǎo)物及轉(zhuǎn)化底物，底物分4次添加，每次間隔12h，最終總濃度達6%，轉(zhuǎn)化過程中攪拌速度優(yōu)化為200r/min，溫度為35℃，沒食子酸濃度可達到39.78mg/mL，轉(zhuǎn)化率達最大值73.05%。在對菌絲重復(fù)轉(zhuǎn)化試驗過程中補加營養(yǎng)物質(zhì)及調(diào)節(jié)pH值均能提高轉(zhuǎn)化產(chǎn)物濃度。

關(guān)鍵詞：黑曲霉；液態(tài)發(fā)酵；五倍子；生物轉(zhuǎn)化；沒食子酸；工藝優(yōu)化

中圖分類號：TQ920.1 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0250-04

沒食子酸（gallicacid，GA）又名五倍子酸，為白色或淡黃色針狀結(jié)晶，化學(xué)性質(zhì)活潑，能形成多種酯類、酰鹵和酰胺，可以通過氧化耦合反應(yīng)制得鞣花酸、脫氫二鞣花酸等聯(lián)苯型化合物，是一種重要的精細化學(xué)品，廣泛應(yīng)用于礦產(chǎn)、化工、農(nóng)業(yè)、食品、制藥等行業(yè)。目前，沒食子酸的制備方法可分為化學(xué)法與生物法，工業(yè)上沒食子酸主要是由化學(xué)法經(jīng)酸或堿水解五倍子制得，其工藝存在對環(huán)境污染嚴(yán)重、副反應(yīng)多、雜質(zhì)含量較高等問題。而生物法因具有反應(yīng)條件相對溫和、對設(shè)備要求低、副產(chǎn)物較少、對環(huán)境友好以及岳續(xù)提純工藝較為簡單等諸多優(yōu)點，近年來受到國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者的廣泛關(guān)注。五倍子富含單寧酸，研究表明單寧酸誘導(dǎo)黑曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞內(nèi)單寧酶，單寧酶可高效、專一、定向裂解單寧酸分子，生成沒食子酸；故直接將五倍子投入發(fā)酵系統(tǒng)中，利用菌體內(nèi)的單寧酶將之轉(zhuǎn)化為沒食子酸。當(dāng)轉(zhuǎn)化趨于平衡后，分離菌絲體并洗滌，可反復(fù)轉(zhuǎn)化五倍子制備沒食子酸。此過程不需要將酶從菌體中分離，將酶的生成與五倍子單寧酸轉(zhuǎn)化沒食子酸的過程相耦合，簡化了沒食子酸的生物轉(zhuǎn)化過程。與酶法轉(zhuǎn)化相比，此方法轉(zhuǎn)化底物濃度有很大倍數(shù)的提高，產(chǎn)物濃度也有很大提高。同時，分光光度法與高效液相色譜法相比，測定沒食子酸是前者由于單寧酸和沒食子酸結(jié)構(gòu)相近，最大吸收峰波長也較近產(chǎn)生累加效應(yīng)，因此產(chǎn)生的干擾比較大，實際測量值會偏大。本試驗通過對底物添加方式、底物濃度、轉(zhuǎn)化方式及轉(zhuǎn)化條件等因素進行研究，以提高沒食子酸相對于五倍子中單寧酸的轉(zhuǎn)化率，為生物法制備沒食子酸的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1試驗材料與儀器

1.1.1菌株黑曲霉B0201（Aspergillusniger），由筆者所在實驗室保藏。

1.1.2培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基；液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖2.0g，NaNO30.2g，K2HPO4·3H2O0.1g，KCl0.05g，MgSO4·7H2O0.05g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.001g，溶于100mL蒸餾水中，pH值自然。

1.1.3主要試劑五倍子，購于貴州省遵義市余慶縣；單寧酸C76H52O46，分析純，購于天津福晨化學(xué)試劑廠；沒食子酸C7H6O5·H2O，分析純，購于貴州迪大生物有限公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4主要試驗儀器722S分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；FA-1004電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；MJ-160B-II霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；Anke TDL-5離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XMTD-204雙功能蒸汽振蕩器（金壇市文華儀器制造有限公司）；島津LC-10AVP高效液相色譜儀（島津有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1產(chǎn)酶

1.2.1.1菌種的活化將保存的黑曲霉B0201轉(zhuǎn)接到察氏斜面培養(yǎng)基后，放入霉菌培養(yǎng)箱中，于30℃條件下培養(yǎng)3～4d后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2種子懸浮液的制備斜面試管加入10mL生理鹽水，洗脫并充分振蕩、稀釋后獲得10⁸個/mL左右的孢子懸浮液。

1.2.1.3黑曲霉B0201發(fā)酵產(chǎn)酶在滅菌的液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加4%的五倍子，接種量2%，裝液量100mL/250mL，搖勻后用紗布封口置于140r/min、30℃的搖床中培養(yǎng)72h，完成發(fā)酵產(chǎn)酶過程。

1.2.2沒食子酸的制備

在產(chǎn)酶系統(tǒng)中直接添加底物轉(zhuǎn)化五倍子單寧酸制備沒食子酸。

1.2.3單寧酸轉(zhuǎn)化率的測定

1.2.3.1沒食子酸相對于單寧酸的轉(zhuǎn)化率計算

1.2.3.2

單寧酸的測定

參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T15686-1995，用紫外分光光度法測定單寧酸含量。（1）單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入2.0mL磷鉬鎢酸試液和10.0mL飽和碳酸鈉溶液，定容到50mL，靜置30min后于4000r/min離心5min，720nm下光譜掃描。以吸收峰值D為縱坐標(biāo)，樣品濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：D=1.325C+0.113，r=0.9990。（2）五倍子中單寧酸含量的測定。取10.0g五倍子于三角瓶中，按1：12的比例加入蒸餾水，于140r/min、40℃下振蕩浸提，每隔12h，取少量浸提液，過濾后按照單寧酸的測定方法測定其含量，最后計算五倍子中單寧酸總的浸出量。

1.2.3.3沒食子酸的測定

（1）液相色譜條件。色譜柱為Waters Symnletryc18（5μm，4.6mm×150mm）；流動相：A相甲醇（85%），B相0.5%乙酸溶液（15%）；檢測波長：273nm；柱溫：40℃；流速：0.8mL/min。（2）沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述液相色譜條件下，各進樣20μL，平行測定5次。以峰面積A為縱坐標(biāo)，樣品濃度c（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=65453.13C-163771.09，r=0.9998。說明沒食子酸在0.0506～O.406μ/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。（3）樣品中沒食子酸含量的測定。取1mL樣品濾液，稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，在上述液相色譜條件下進樣20μL，平行測定5次，根據(jù)回歸方程計算沒食子酸的平均含量。

2.結(jié)果與分析

2.1單寧酸浸提率與浸提時間的關(guān)系

按照五倍子中單寧酸含量的測定方法，所得到單寧酸的浸提率（浸提液中單寧酸的生成量與五倍子的添加量的比值）與浸提時間的關(guān)系見圖l。由圖1看出，隨著浸提時間的不斷延長，單寧酸不斷從五倍子中浸提出來，浸提時間72h時，浸提率達到55%，之后浸提率達到平穩(wěn)。這說明單寧酸隨浸提時間的延長，不斷從五倍子中浸提出來，最終達到穩(wěn)定值55%左右。單寧酸的浸提曲線可以反映實際可利用的單寧酸量，故可為單寧酸轉(zhuǎn)化率的計算提供依據(jù)。

2.2不同轉(zhuǎn)化方式對轉(zhuǎn)化率的影響

轉(zhuǎn)化方式分2種：（1）將產(chǎn)酶菌絲分離，并用蒸餾水反復(fù)洗滌后，轉(zhuǎn)入100mL含4%五倍子的溶液中，140r/min、30℃條件下轉(zhuǎn)化，一定時間后測定轉(zhuǎn)化液中沒食子酸含量。（2）直接在發(fā)酵產(chǎn)酶系統(tǒng)中補加4%的五倍子，140r/min、30℃條件下繼續(xù)轉(zhuǎn)化，測定轉(zhuǎn)化液中沒食子酸的含量。按不同的轉(zhuǎn)化方式，在120h和170h時沒食子酸含量見表1。從表1可以看出，用相同量的誘導(dǎo)物和轉(zhuǎn)化底物，轉(zhuǎn)化120h和170h時菌絲球轉(zhuǎn)化產(chǎn)物總質(zhì)量分別為3.5537、3.2943g，而直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物總質(zhì)量分別為3.6598、3.3888g。2種轉(zhuǎn)化方式所得到的沒食子酸總質(zhì)量差別不大。故從節(jié)省操作工序的角度考慮，選擇直接添加五倍子粉轉(zhuǎn)化的方式。

2.3不同的誘導(dǎo)物、底物形式對轉(zhuǎn)化率的影響

分別在液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入4%五倍子和2%單寧酸（相當(dāng)于4%的五倍子中單寧酸量），培菌產(chǎn)酶結(jié)束后，再分別在相應(yīng)的培養(yǎng)基中添加4%五倍子和2%單寧酸作為底物，于140r/min、30℃條件下轉(zhuǎn)化，然后每隔8h測定轉(zhuǎn)化液中沒食子酸的含量，結(jié)果見圖2。由圖2看出，利用五倍子作為誘導(dǎo)物和底物時，轉(zhuǎn)化到120h時趨于平衡，轉(zhuǎn)化率可以達到73%以上；而利用單寧酸作為誘導(dǎo)物和底物時，剛開始得率相對較高，轉(zhuǎn)化到90h時，轉(zhuǎn)化趨于平衡，轉(zhuǎn)化率為63.5%，平衡時用五倍子轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化率明顯偏高。這可能是由于用單寧酸轉(zhuǎn)化時底物與酶結(jié)合空間阻礙小，轉(zhuǎn)化速度快，其先達到底物飽和濃度，過量的單寧酸又會抑制產(chǎn)物的生成；而用五倍子作為底物時單寧酸是緩慢浸提出來的，前期轉(zhuǎn)化速度慢，且低濃度的底物不會產(chǎn)生抑制效應(yīng)，一定時間后才會達到飽和濃度，同時也能減少單寧酸制備過程。故選用五倍子作為誘導(dǎo)物和底物。

2.4底物添加方式對轉(zhuǎn)化率的影響

培菌產(chǎn)酶結(jié)束后，采用分批補料方式，在上述相同的轉(zhuǎn)化條件下轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化過程中每隔12h添加2.0%的五倍子，與在相同的轉(zhuǎn)化時間內(nèi)一次性補料添加相同量的五倍子對照，2種底物的添加方式對沒食子酸生產(chǎn)的影響情況見圖3。在分批添加底物的過程中，pH值的變化情況見圖4。由圖3和圖4可以看出，對于相同的轉(zhuǎn)化時間分批補料有利于提高沒食子酸的產(chǎn)量，隨著轉(zhuǎn)化時間延長，沒食子酸濃度增大，最高達43.85mg/mL；但轉(zhuǎn)化率先增大后降低，濃度最大時轉(zhuǎn)化率只有56.95%，且pH值不斷降低，最后都趨于穩(wěn)定。這可能是因為分批補料有利于底物的持續(xù)供給，有利于轉(zhuǎn)化，且pH值的下降可能對酶活起抑制作用，不利于轉(zhuǎn)化。故分批補料對轉(zhuǎn)化起積極作用；需在轉(zhuǎn)化過程中加強調(diào)節(jié)pH值，以利于酶的穩(wěn)定及作用的發(fā)揮。

2.5底物分批添加累積濃度對轉(zhuǎn)化率的影響

培菌產(chǎn)酶結(jié)束后，按每隔12h分別添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的五倍子底物，共添加4次，考察五倍子累積添加量分別為4.0%、6.0%、8.0%、10.0%時對沒食子酸產(chǎn)量的影響，不同底物濃度對產(chǎn)物濃度及轉(zhuǎn)化率的影響見圖5和圖6。由圖5和圖6可以看出，隨著底物濃度增大，沒食子酸濃度從32.29mg/mL增加到41.46mg/mL；轉(zhuǎn)化率從75.64%降低到58.56%。底物濃度累積量為4%和6%時，兩者轉(zhuǎn)化率相差不大，但后者沒食子酸濃度較前者高出很多，最大濃度為39.78mg/mL時，轉(zhuǎn)化率為73.05%。故選擇最佳終濃度為6%，添加4次，每次1.5%，濃度為39.78mg/mL時，轉(zhuǎn)化率為73.05%。

2.6轉(zhuǎn)化條件對轉(zhuǎn)化率的影響

培菌產(chǎn)酶結(jié)束后，在分批補料的條件下，轉(zhuǎn)化過程中采用不同的轉(zhuǎn)速140、160、180、200、220r/min，對沒食子酸的影響見圖7；采用不同的轉(zhuǎn)化溫度25、30、35、40、45℃，對沒食子酸產(chǎn)量的影響見圖8。由圖7可知，隨著轉(zhuǎn)速提高，轉(zhuǎn)化率先增加后降低，當(dāng)達到200r/min時轉(zhuǎn)化率達到最大值。主要原因可能是轉(zhuǎn)速直接影響發(fā)酵環(huán)境均勻性，轉(zhuǎn)速太小，原料沉降與菌體分離，酶與底物結(jié)合空間受阻礙不利于轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)速過大，對菌絲的剪切力較大，損傷菌絲，不利于菌絲的穩(wěn)定生長及產(chǎn)酶。故200r/min是最佳的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)速。由圖8可知，溫度對轉(zhuǎn)化率的影響不顯著，在30～40℃均有較高的轉(zhuǎn)化率。溫度對轉(zhuǎn)化率的影響主要體現(xiàn)在2個方面：其一可能是溫度升高時有利于單寧酸的提取溶出；其二酶是具有生物活性的大分子，在酶的最適作用的溫度范圍內(nèi)，較高溫度有利于提高酶反應(yīng)速度。故選用35℃作為轉(zhuǎn)化溫度。

2.7菌絲轉(zhuǎn)化次數(shù)對轉(zhuǎn)化率的影響

培菌產(chǎn)酶結(jié)束后，按上述優(yōu)化條件進行第一次轉(zhuǎn)化結(jié)束后，即最后一次投料后繼續(xù)轉(zhuǎn)化12h，將菌絲球分離洗滌，重新按上述方法添加五倍子粉重復(fù)4次轉(zhuǎn)化試驗；并直接將菌絲轉(zhuǎn)移到含有50%劑量的察氏培養(yǎng)基中添加五倍子粉進行轉(zhuǎn)化或用稀氨水調(diào)節(jié)pH值，使之維持在4.5左右的方式來考察對轉(zhuǎn)化率的影響，其轉(zhuǎn)化情況見表2。由表2可以看出，隨著轉(zhuǎn)化次數(shù)的增加，相同的底物所得到的沒食子酸的濃度越來越低。這可能是由于洗滌過程中導(dǎo)致酶的損失，使酶量減少，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率不斷下降。同時可以看出，添加少量的營養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)節(jié)pH值條件下沒食子酸的濃度都比對照高。這可能是因為轉(zhuǎn)化過程中更換發(fā)酵培養(yǎng)基，菌體環(huán)境變化，補充營養(yǎng)物質(zhì)有利于維持菌體活性，保證酶活；隨著沒食子酸的不斷積累pH值下降，添加氨水保證了酶作用的pH值，提高了酶活，同時也為菌體補充氮源，從而提高了轉(zhuǎn)化率，且效果比單純添加營養(yǎng)物質(zhì)的好。故在對菌絲重復(fù)轉(zhuǎn)化試驗過程中補加營養(yǎng)物質(zhì)及調(diào)節(jié)pH值使轉(zhuǎn)化產(chǎn)物濃度均有所提高。

3.結(jié)論

目前，有關(guān)生物法制備沒食子酸的報道，國內(nèi)外都取得了一定的進展。楊亞力等以五倍子為底物用黑曲霉進行轉(zhuǎn)化試驗，其發(fā)酵液中沒食子酸累積濃度達到25.6mg/mL，以五倍子中提取物單寧酸來計算沒食子酸相對轉(zhuǎn)化率為51.1%；Beena等報道了以單寧酸作為誘導(dǎo)物，利用菌株（AspergillusawamonBTMFW032）進行深層液態(tài)發(fā)酵，通過發(fā)酵84h，沒食子酸的濃度可以達到372.6μg/mL；Seth等以單寧酸作為底物，利用Aspergillusawamoni，持續(xù)發(fā)酵60h，沒食子酸的濃度可以達到19g/L，發(fā)酵作用100h左右，所積累的沒食子酸濃度達到最大，為40.3g/L。

本試驗利用黑曲霉B0201菌株產(chǎn)單寧酶，研究在不同條件下轉(zhuǎn)化五倍子制備沒食子酸，最終確定液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化沒食子酸的工藝條件為：采用不分離菌體直接轉(zhuǎn)化方式，將五倍子作為產(chǎn)酶的誘導(dǎo)物及轉(zhuǎn)化底物，采用分批補料方式，分4次添加，每次間隔12h，底物累積濃度6%，轉(zhuǎn)化過程攪拌速度為200r/rain，轉(zhuǎn)化溫度為35℃，該試驗在轉(zhuǎn)化液中沒食子酸濃度達到39.78mg/mL時，沒食子酸相對于單寧酸的得率達到最高（73.05%），與以上報道的相比，在現(xiàn)有的報道中最高。但菌絲連續(xù)多次轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)化能力下降，添加少量營養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)節(jié)pH值對菌絲球重復(fù)轉(zhuǎn)化起積極作用，調(diào)節(jié)pH值的積極轉(zhuǎn)化效果比添加少量營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化效果明顯。