馬俊紅　李軍營　馬二登　盧秀萍

摘要：為了研究烤煙不同生育期蔗糖代謝的分子特點(diǎn)，采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法對云煙87在不同生育期的3種蔗糖代謝關(guān)鍵酶基因——轉(zhuǎn)化酶（invertase，Inv）、蔗糖合成酶（sucrose synthase，SuSy）和蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果表明：在煙葉發(fā)育前期（團(tuán)棵期、旺長期）Inv酶基因的表達(dá)量較高；SuSy酶基因的在烤煙不同生育期的表達(dá)量變化呈單峰曲線，在打頂后表達(dá)量最高，之后又降低。SPS酶基因的表達(dá)量在烤煙生長發(fā)育后期較高，說明烤煙蔗糖的累積主要在發(fā)育后期進(jìn)行。

關(guān)鍵詞：烤煙；生育期；蔗糖代謝；轉(zhuǎn)化酶；蔗糖合成酶；蔗糖磷酸合成酶；基因表達(dá)

中圖分類號：S572.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0032-03

烤煙是世界上一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙葉的品質(zhì)與其糖含量密切相關(guān)，水溶性糖與氨基酸發(fā)生梅拉德反應(yīng)可以產(chǎn)生多種香氣物質(zhì)。蔗糖是主要的水溶性糖之一，也是煙草光合作用的主要產(chǎn)物，可以為煙草的生長提供碳源和能量，同時(shí)也是細(xì)胞代謝的調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、貯藏蛋白和編碼酶的基因的表達(dá)。與蔗糖代謝密切相關(guān)的酶主要有轉(zhuǎn)化酶（invertase，Inv）、蔗糖合成酶（sucrose syn-thase，SuSy）和蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）。SPS是調(diào)控植物蔗糖合成的關(guān)鍵酶之一，其活力直接影響光合產(chǎn)物的分配，研究表明其與蔗糖形成呈正相關(guān)。SuSy是一種可逆酶，既可催化蔗糖的合成，又可催化蔗糖的分解，通常認(rèn)為，它主要起分解蔗糖的作用，能為細(xì)胞壁提供合成底物和合成淀粉。Inv酶與植物體內(nèi)形成蔗糖梯度相關(guān)，Bachelier等研究表明，處在細(xì)胞壁中的轉(zhuǎn)化酶能調(diào)節(jié)蔗糖從韌皮部卸出，并且控制蔗糖吸收速度，而在液泡中的轉(zhuǎn)化酶則可以調(diào)節(jié)蔗糖和己糖的貯存。

本研究通過對烤煙品種云87在團(tuán)棵期、旺長期、現(xiàn)蕾期、打頂后、成熟期5個(gè)生育期的蔗糖含量，Inv酶、SuSy酶、SPS酶活性以及3個(gè)酶基因的表達(dá)情況進(jìn)行測定，從而明確不同生育期蔗糖代謝主要酶活性及酶基因的變化特點(diǎn)，揭示烤煙不同生育期蔗糖代謝的分子特點(diǎn)，并為改善烤煙品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1供試材料

試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在云南省玉溪研和基地，在移栽后第20天（團(tuán)棵期）、第40天（旺長期）、第60天（現(xiàn)蕾期）、第80天（打頂后）、第1130天（成熟期）采集云煙87的第12張葉（自下而上），將新鮮煙葉1g放入液氮罐冷凍后，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取

總RNA提取按照RNAiso Plus和RNAiso-mate fnr Plant Tissue試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]說明書進(jìn)行。用核酸蛋白紫外分析儀檢測D260nm/D280nm的比值以鑒定RNA抽提質(zhì)量，1.8≤D260nm/D280nm≤2.0，表明總RNA質(zhì)量較好，同時(shí)測定其標(biāo)本總RNA濃度。

1.2.2總RNA的反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用PrimeSeriptⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]進(jìn)行，具體方法參照試劑盒說明書。

1.2.3引物設(shè)計(jì)選擇內(nèi)參基因Actin以及3個(gè)關(guān)鍵酶基因（蔗糖合成酶基因、蔗糖磷酸合成酶基因以及蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因），按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)原則，避免引物3'端互補(bǔ)，以及“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)，引物的長度為18～22bp，注意堿基的隨機(jī)分配，GC含量在40%～60%之間，擴(kuò)增片段小于200bp。并應(yīng)用Primer3（v.0.4.0）軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物。引物合成由Inviirogen公司完成。引物序列見表1。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析以受試材料葉片反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，Real—time qPCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑SYBRPremix Ex TaqI（Perfect Real Time）來自寶生物工程（大連）有限公司。Real-time qPCR擴(kuò)增和分析在Mx3005PQPCR System熒光定量PCR儀（stratagene）上進(jìn)行，采用96孔反應(yīng)模塊。反應(yīng)體系：2×SYBR Premix 12.5uL，F(xiàn)orwardPrimer0.4umol/L，Reverse Primer 0.4 txmol/L，Rox1 txmol/L，補(bǔ)充至25uL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 qC 30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5s，58℃ 30s，45個(gè)循環(huán)；95℃ 30s，58℃ 1min，95℃ 1min，1個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，65～95℃產(chǎn)生溶解曲線，閾值線由Mx Pro軟件自動(dòng)設(shè)定。每個(gè)樣品重復(fù)3次，不同時(shí)期樣品的表達(dá)量檢測均在相同的real—time PCR循環(huán)中進(jìn)行，以保證標(biāo)準(zhǔn)樣品和處理樣品擴(kuò)增條件一致。

1.2.5數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)結(jié)果最少是3次試驗(yàn)的平均值。用2的方法計(jì)算待測基因的相對表達(dá)水平。其中，各基因在對照情況下的相對表達(dá)量設(shè)定為1.0。采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖，采用SISS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.結(jié)果與分析

2.1烤煙不同生育期蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)分析

蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Inv）的活性標(biāo)志著植物葉片對光合產(chǎn)物利用的強(qiáng)度，也是碳代謝的重要標(biāo)志之一。從圖1中可以看出，烤煙蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)隨著烤煙的生長發(fā)育從團(tuán)棵期到成熟期逐漸減弱，在團(tuán)棵期Inv酶基因的表達(dá)最強(qiáng)，從旺長到現(xiàn)蕾期Inv酶基因的表達(dá)量急劇降低，從現(xiàn)蕾期至成熟期表達(dá)量維持在較低水平，且相對比較穩(wěn)定。說明在煙葉發(fā)育早期主要由Inv酶催化蔗糖的水解，且在發(fā)育的早期煙株對光合產(chǎn)物利用的強(qiáng)度最大。而后期Inv酶基因的表達(dá)量降低有助于煙葉蔗糖的累積。

2.2烤煙不同生育期蔗糖合成酶基因的表達(dá)分析

蔗糖合成酶是促使蔗糖進(jìn)入各種代謝途徑的關(guān)鍵酶之一。從圖2可以看出，云煙87蔗糖合成酶基因的表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，從團(tuán)棵期、旺長期到現(xiàn)蕾期逐漸升高，在打頂獲普蔗糖合成酶基因的表達(dá)量急劇升高，同時(shí)達(dá)到最大值，到成熟期表達(dá)量則急劇下降，說明在煙葉生長后期，蔗糖降解主要通過蔗糖合成酶途徑來完成的，而成熟期煙葉需要累積蔗糖，因而SuSy酶基因的表達(dá)量下降，有助于煙葉適時(shí)成熟。

2.3烤煙不同生育期蔗糖磷酸合成酶基因的表達(dá)分析

蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物體內(nèi)控制蔗糖合成的關(guān)鍵酶。植物體內(nèi)蔗糖的積累與SIS活性正相關(guān)，SIS還參與植物的生長和產(chǎn)量形成，并在植物的抗逆過程中起重要作用。從圖3可以看出，云煙87在團(tuán)棵期、旺長期、現(xiàn)蕾期3個(gè)時(shí)期的蔗糖磷酸合成酶基因表達(dá)量均較低，而打頂后和成熟期的SIS基因表達(dá)量較高，且遠(yuǎn)高于煙株生長發(fā)育前3個(gè)時(shí)期的表達(dá)量，說明烤煙蔗糖的累積主要在烤煙生長發(fā)育后期進(jìn)行。

3.結(jié)論與討論

蔗糖是高等植物光合作用的主要產(chǎn)物，參與蔗糖代謝和積累的酶主要包括蔗糖轉(zhuǎn)化酶、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶。本研究首次應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法，對云南烤煙不同生育期蔗糖代謝和積累過程中的3種主要酶基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。蔗糖是觸發(fā)衰老的因子，糖分的積累會(huì)抑制光合基因的表達(dá)，從而引起煙葉的早衰。Huber曾指出SPS酶活力越高，蔗糖積累的越多。同樣，本試驗(yàn)的研究結(jié)果也表明，SPS基因表達(dá)量在烤煙生長發(fā)育前期較低，蔗糖積累相應(yīng)較少，不會(huì)導(dǎo)致煙葉早熟，而在后期表達(dá)量較高，蔗糖積累量較多，有利于煙葉適時(shí)成熟。

蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)隨植物生長發(fā)育時(shí)期的不同而改變，存在時(shí)間和空間的差異。Inv被認(rèn)為參與了植物的生長和器官建成。許多研究表明，一般在植物的分生組織和快速生長的幼嫩的組織和器官中（如幼嫩的葉片、莖、花芽、根尖、幼嫩的果實(shí)等）Inv活性較高。同樣，本研究也證實(shí)了這一結(jié)論，Inv酶基因的表達(dá)在團(tuán)棵期和旺長期最強(qiáng)，即在烤煙生長發(fā)育的前期，此時(shí)煙葉幼嫩，而到后期則該基因的表達(dá)量下降。

在煙葉發(fā)育早期主要由Inv酶催化蔗糖的水解，到生長后期，蔗糖降解主要通過蔗糖合成酶催化的途徑來完成。本研究顯示，云煙87在打頂后SuSy酶基因的表達(dá)量最高，而這一生育期的Inv酶基因的表達(dá)量則較低，說明打頂后蔗糖降解的主要途徑通過蔗糖合成酶催化來完成的。而在成熟期Inv和SuSy酶基因的表達(dá)量均較低，可能是因?yàn)樵诔墒炱跓熑~需要累積蔗糖，從而達(dá)到適時(shí)成熟。

但是，由于蔗糖代謝過程中還涉及到眾多的其他酶，同時(shí)，人們對基因表達(dá)與酶活性的之間對應(yīng)關(guān)系了解的也并不透徹，因此，蔗糖的積累與Inv酶、SPS酶、SuSy酶基因表達(dá)以及酶活性的精確關(guān)系還有待于進(jìn)一步的研究。