陳翠萍等

摘要：多室油菜具有多室多粒的特征，是提高油菜產(chǎn)量的一個有效途徑。利用青海芥菜型多室油菜的BC4分離群體對油菜多室基因Bjln2進行初步定位，對分離群體的性狀分離比進行卡方檢測，檢測結(jié)果符合1 ∶1，表明多室性狀遺傳穩(wěn)定。利用擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）與分群分析法（bulk segregate analysis，BSA） 相結(jié)合的方法共篩選獲得3個與目標(biāo)基因緊密連鎖的標(biāo)記。連鎖遺傳分析的結(jié)果表明，3個AFLP標(biāo)記均位于基因Bjln2的同側(cè)，其中SA03MC16距Bjln2基因最近，遺傳距離約為13.1 cM；SA14MC13距Bjln2基因最遠，遺傳距離約為23.5 cM；圖譜總長23.5 cM，標(biāo)記間平均圖距為7.8 cM。研究結(jié)果為多室基因的精細定位及圖位克隆奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：青海??；芥菜型油菜；多室；基因定位；擴增片段長度多態(tài)性；分群分析法

中圖分類號： Q785文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0032-03

收稿日期：2015-03-19

基金項目：國家“863”計劃（編號：2011AA10A104）；青海省重點實驗室發(fā)展專項（編號：2014-Z-Y11）。

作者簡介：陳翠萍（1989—），女，陜西渭南人，碩士研究生，研究方向為春油菜分子生物學(xué)。E-mail：chencuiyang@126.com。油菜是世界4大油料作物之一，在世界油料作物中占有重要地位。一般來說，油菜的成熟角果內(nèi)有膜狀隔膜（或稱假隔膜），將每個角果分為2室，外被2片殼狀果瓣；多室油菜的角果被假隔膜分為3～4室，外被3～4片殼狀果瓣。油菜的多室性狀在目前種植的3大類型油菜中均有發(fā)現(xiàn)：在芥菜型油菜中，有山西省的三筒油菜、貴州省的四輪油菜、青海省的多室油菜、四川省的四棱油菜；白菜型油菜中有印度沙遜油菜、西藏的桑日白油菜等；甘藍型油菜中有三棱角油菜、人工創(chuàng)造的甘藍型多室油菜[1-3]。趙洪朝等發(fā)現(xiàn)，多室油菜的單株產(chǎn)量顯著高于相同遺傳背景下2室油菜的單株產(chǎn)量，主要原因是多室油菜角粒數(shù)多[4-6]。

呂澤文等對芥菜型多室和2室角果、子房石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，多室角果由4心皮發(fā)育而來，4個果瓣包圍種子，2個假隔膜平行，將角果分隔成3個腔室，中間的腔室大于兩側(cè)的腔室[5]。有學(xué)者對白菜型多室油菜的雌蕊子房橫切切片觀察發(fā)現(xiàn)，多室油菜的子房有12～16個心皮維管束，子房在發(fā)育過程中心皮連成1個圓環(huán)，之后房室開始分化，胚珠、假隔膜同時發(fā)生。朱彥濤對甘藍型多室研究發(fā)現(xiàn)，多室角果橫切面呈3室，隔膜橫截面呈“Y”形[7]。

Varshney對印度沙遜油菜進行研究發(fā)現(xiàn)，角果果室性狀受1對基因控制，且2室對多室表現(xiàn)完全顯性[8]。何余堂等研究表明，白菜型油菜的多室性狀受1對隱性基因控制[9]。Choudhary對印度芥菜型多室油菜研究發(fā)現(xiàn)，2室為顯性性狀，4室為隱性性狀，多室性狀受2對隱性基因控制[10-11]。趙洪朝等對芥菜型多室性狀的遺傳規(guī)律進行研究發(fā)現(xiàn)，多室性狀的遺傳受1對主效基因控制，且被微效基因所修飾，無胞質(zhì)效應(yīng)[12]。呂澤文利用甘肅芥菜型多室油菜為材料，證實多室性狀受2對獨立遺傳的隱性核基因控制，且多室性狀無細胞質(zhì)效應(yīng)，遺傳穩(wěn)定，將這2對多室基因分別命名為mc1、mc2[13]。初步定位的結(jié)果表明，mc1基因位于A基因組上。Xiao等對青海芥菜型多室油菜遺傳分析表明，多室性狀受2個獨立遺傳的基因控制，且多室為隱性性狀，無胞質(zhì)效應(yīng)，分別定義為Bjln1、Bjln2[14]。

獲得與多室性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記為多室性狀基因定位及克隆奠定基礎(chǔ)，同時也有利于利用分子標(biāo)記對多室性狀進行快速而準(zhǔn)確的跟蹤，從而加速多室油菜的選育進程[15-16]。Xu等利用擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）分子標(biāo)記對Mc1進行精細定位，篩選到目標(biāo)基因Mc1兩側(cè)最近的連鎖標(biāo)記EC14MC14、SC20，分別距離Mc1 1.1、1.6cM，將Mc1定位于A基因組第7染色體上，構(gòu)建了Mc1的連鎖圖譜[17]。Xiao等通過AFLP和SSR分子標(biāo)記，篩選到與Bjln1緊密連鎖的2個AFLP標(biāo)記和7個SSR標(biāo)記，將多室基因Bjln1進行基因定位，將控制多室的Bjln1基因定位到A7連鎖群的約208 kb左右的區(qū)域內(nèi)[14]。

Fan等利用多室突變體m14和二室野生型白菜型油菜為材料，通過對CLV3類似物的分離和功能特性的研究認為，單核苷酸替代（T-C）后的新型BrCLV3是控制頂端分生組織大小、腔室和角果粒數(shù)多少的主要原因[18]。表達分析表明，反饋回路中涉及到CLV3、WUS的假定的負調(diào)控途徑在m14突變體中被中斷。

番茄中也有多室性狀的研究。Muos等對番茄多室性狀研究時發(fā)現(xiàn)，番茄的多室性狀主要受2對QTL控制，分別為fas、lc 2對基因相互影響[19]。lc QTL包括1 600 bp堿基，距WUSCHEL 3′末端1 080 bp堿基，通過編碼蛋白質(zhì)調(diào)控莖細胞。lc的分子進化顯示，2個單核苷酸多態(tài)性的異常導(dǎo)致遺傳多樣性降低，2個單堿基的突變導(dǎo)致了果室數(shù)目的增加。并認為果室數(shù)目的進化模型是fas突變出現(xiàn)在lc突變之后從而導(dǎo)致極端多室的形成，使番茄產(chǎn)量提高數(shù)倍。

本研究所用材料為青海芥菜型多室油菜，除具有多室性狀外，還具有黃籽、抗裂角等優(yōu)良性狀，是一種優(yōu)異的種質(zhì)資源[4，20]。遺傳分析結(jié)果表明，青海芥菜型油菜多室性狀受2個獨立遺傳的基因位點控制，即Bjln1、Bjln2，多室對2室為隱性，無胞質(zhì)效應(yīng)[14]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，以青海芥菜型油菜多室回交分離群體BC4為材料，利用AFLP標(biāo)記[21]結(jié)合分群分析法（bulk segregate analysis，BSA）[22]，初步尋找與芥菜型油菜多室基因Bjln2緊密連鎖的分子標(biāo)記，建立芥菜型油菜角果多室基因Bjln2位點所在區(qū)域的遺傳連鎖圖譜，為該基因的精細定位和克隆奠定基礎(chǔ)。同時，緊密連鎖的分子標(biāo)記可將果室性狀的鑒定提早到苗期進行，從而加快育種進程，提高育種效率[23]。

1材料與方法

1.1材料與群體構(gòu)建

本試驗所用親本為青海芥菜型多室油菜和新芥（2室），青海芥菜型多室油菜是源于青藏高原的一種地方品種，有3～4個心皮。材料均由青海省農(nóng)林科學(xué)院春油菜研究所提供，經(jīng)過自交7代以上，多室性狀可以穩(wěn)定遺傳。青海芥菜型多室油菜與新芥雜交，獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代，F(xiàn)2代與親本多室油菜連續(xù)回交4代，得到包含1 754株的BC4分離群體，并隨機挑選198株單株作為試驗用的作圖分離群體。

1.2DNA 的提取及樣品池的構(gòu)建

在油菜苗期，對田間單株進行編號。植株長至4～5張真葉時，每個單株取2～3 cm2的新鮮葉片，用CTAB小樣法提取葉片總 DNA，具體方法參考Doyle等的方法[24]并略作改動。DNA濃度及質(zhì)量用紫外分光光度計檢測（Eppendorf Spectrophotometer，Biophotometer），再用TE緩沖液稀釋至50 ng/μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在油菜角果成熟期，對田間單株進行性狀調(diào)查。油菜2室與多室性狀鑒定采用肉眼鑒定的方法。單株多室角果率>95%記為多室株，沒有多室角果的單株記為2室株。根據(jù)田間調(diào)查結(jié)果，在BC4群體中隨機選擇12個多室單株和12個2室單株，每6個單株的DNA等量混合，分別構(gòu)建2個多室基因池和2個2室基因池，用于BSA分析。

1.3AFLP分析

AFLP分析參考陸光遠提到的Vos等的方法[25]并略作改動。采用的酶切組合為SacⅠ/MseⅠ，預(yù)擴增采用的引物組合為 SA/MC，預(yù)擴產(chǎn)物稀釋30倍后作為選擇性擴增的模板。將等體積的選擇性擴增產(chǎn)物和Loading Buffer （98%甲酰胺，0.025%二甲苯藍，0.025%溴酚藍，10 mmol/L EDTA，pH值8.0）混合，然后用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，硝酸銀染色觀察結(jié)果。

利用已構(gòu)建好的多室基因池、2室基因池進行引物篩選。有特異性的引物再在BC4群體中隨機挑選6株2室株、6株多室株進行驗證。

1.4連鎖分析

利用得到的AFLP標(biāo)記對BC4分離群體中隨機挑選的198株單株進行檢測，結(jié)合田間性狀調(diào)查結(jié)果，篩選交換單株，計算重組率。利用JoinMap 4.0 軟件構(gòu)建遺傳圖譜，先用New project創(chuàng)建1個新的文件夾，用Load data 導(dǎo)入標(biāo)記數(shù)據(jù)，再用Kosambi函數(shù)[26]將重組率轉(zhuǎn)換為遺傳距離，最后用Map Draw 構(gòu)建連鎖圖譜。

2結(jié)果與分析

2.1BC4分離群體果室性狀表現(xiàn)

青海芥菜型多室油菜和新芥（2室）連續(xù)回交4代獲得的BC4分離群體有效單株共1 754株，其中多室單株882株，2室單株872株。經(jīng)卡方檢測，結(jié)果符合1 ∶1（χ2=0.057）（表1）。

2.2與Bjln2基因連鎖的AFLP標(biāo)記

利用已構(gòu)建的多室基因池、2室基因池進行AFLP標(biāo)記的篩選，將篩選得到的標(biāo)記在BC4分離群體的單株中進行驗證，最終確定3個AFLP標(biāo)記與Bjln2基因緊密連鎖。3個AFLP標(biāo)記用于掃描BC4群體中的198個單株 （圖1）。

2.3遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

將BC4群體中198個單株的性狀和3個與Bjln2基因緊密連鎖的AFLP性標(biāo)記數(shù)據(jù)導(dǎo)入JoinMap 4. 0軟件，分析3個標(biāo)記與Bjln2基因的相對位置及距離。結(jié)果表明，這3個標(biāo)記均位于Bjln2的同側(cè)，其中SA03MC16距Bjln2基因最近，遺傳距離約為13.1 cM；SA14MC13距Bjln2基因最遠，遺傳距離約為23.5 cM；圖譜總長23.5 cM，標(biāo)記間平均圖距為7.8 cM（圖2）。

3結(jié)論與討論

目前，多室性狀在油菜3大栽培種（甘藍型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜）中均有發(fā)現(xiàn)。多項研究表明，多室油菜的單株產(chǎn)量顯著高于其對應(yīng)的二室油菜的單株產(chǎn)量，主要原因是多室油菜角粒數(shù)較多，因此油菜多室性狀對油菜產(chǎn)量的提高具有重要意義[4-6]。前人對青海芥菜型多室油菜的遺傳規(guī)律和基因定位進行了探究，證實其多室性狀是受2對獨立遺傳的基因控制，無胞質(zhì)效應(yīng)，并分別命名2對基因為Bjln1、Bjln2。同時進一步對Bjln1進行基因定位，將Bjln1基因定位到A7連鎖群的約208 kb左右的區(qū)域內(nèi)[14]。

本研究對因Bjln2基因進行初步定位。對BC4分離群體性狀分離卡方檢測后符合1 ∶1，證明多室性狀遺傳規(guī)律的穩(wěn)定性，為多室基因Bjln2的定位奠定基礎(chǔ)。利用256對AFLP引物進行引物篩選，共獲得3個與目標(biāo)基因連鎖的AFLP標(biāo)記，均位于Bjln2基因的同側(cè)，其中SA03MC16距Bjln2基因最近，遺傳距離約為13.1cM；SA14MC13距Bjln2基因最遠，遺傳距離約為23.5cM；圖譜總長23.5 cM，標(biāo)記間平均間距為7.8 cM。Xu等將Mc1定位到A基因組7號染色體上，兩側(cè)最近的標(biāo)記距離分別為1.1、1.6cM，構(gòu)建了Mc1的連鎖圖譜[17]。黃籽沙遜既有2室又有3室材料，Yadava等利用F2、F6、F7群體進行QTL定位，發(fā)現(xiàn)控制多室位點的基因位于A4連鎖群，同時利用單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphism，SNP）將其定位到Bra034340，與擬南芥中的CLAVATA3同源，并將此作為候選基因[27]。這與Fan等的研究結(jié)果[18]類似。由于本研究還未將Bjln2基因定位到染色體上，因此Bjln2基因是否與Fan等或Xu等報道的是同一個位點還不可知。

本研究所得的4個AFLP標(biāo)記均位于Bjln2一側(cè)，且分布較為分散，這可能與所選的酶切組合有關(guān)，且本研究所選酶切組合較少，缺少有關(guān)EcoRⅠ/MseⅠ、PstⅠ/MseⅠ的酶切組合，所以沒能篩選到足夠多的AFLP標(biāo)記，因此要盡量篩選出更多的與Bjln2緊密連鎖的分子標(biāo)記。隨著與Bjln2連鎖的分子標(biāo)記的增加，遺傳圖譜的精度會不斷提高，有利于多室基因的圖位克隆。甘藍型油菜是目前種植面積最大的栽培種，克隆獲得的多室基因可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入甘藍型油菜，從而加快甘藍型油菜的育種進程，提高油菜產(chǎn)量[28-37]。

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