王李平，林　晨，方　軍，蔡大川，林澤鵬，方　麗，吳凌濤，李雪瑩

（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心，廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070）

凝膠色譜-氣相色譜法測(cè)定11種動(dòng)植物油脂中角鯊烯的含量

王李平，林晨*，方軍，蔡大川，林澤鵬，方麗，吳凌濤，李雪瑩

（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心，廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070）

動(dòng)植物食用油經(jīng)環(huán)己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）萃取后，用凝膠色譜法對(duì)油樣品進(jìn)行凈化處理，去除樣品中大分子的油脂，再采用氣相色譜法對(duì)動(dòng)植物食用油中角鯊烯進(jìn)行測(cè)定，以建立多種動(dòng)植物油中角鯊烯的凝膠色譜-氣相色譜（GPC-GC-FID）測(cè)定方法。在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，角鯊烯在9.40～940μg·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.9999，方法回收率為95.7%，RSD為3.0%。該方法處理后的食用油樣品中干擾基質(zhì)少，靈敏度高，可有效避免檢測(cè)過(guò)程中儀器的污染，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物食用油中角鯊烯的檢測(cè)，為評(píng)判動(dòng)植物食用油標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

凝膠色譜，氣相色譜法，動(dòng)植物食用油，角鯊烯

角鯊烯（Squalene）又名鯊烯、鯊萜，分子式為C30H50，是一種高度不飽和的直鏈三萜烯類(lèi)化合物。在常溫下呈無(wú)色油狀液體，具有令人愉快的氣味［1］。Tsujimoto最早在黑鯊魚(yú)肝油中發(fā)現(xiàn)了角鯊烯［2-3］，其為生物體內(nèi)自然合成產(chǎn)生的一種活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)多種生理功能的作用，如提高超氧化物歧化酶（SOD）活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、滲透、擴(kuò)散和殺菌等［4-5］，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于保健食品、化妝品及醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域。

角鯊烯普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)，深海鯊魚(yú)肝臟含量最高，其次為植物油，如橄欖油和棕櫚油含量較高，米糠油、油茶籽油次之。目前對(duì)食用油中角鯊烯的分析方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［6-8］、氣相色譜法［9-13］和氣質(zhì)聯(lián)用法［14-18］。液相色譜主要是以反相液相色譜配紫外檢測(cè)器應(yīng)用為主，其流動(dòng)相主要為甲醇/乙醇-水體系，但由于角鯊烯的極性較小，難溶解于此體系中，并且其紫外吸收較弱，故限制了其在液相色譜檢測(cè)中的應(yīng)用。氣質(zhì)聯(lián)用法雖檢出限較低，但其對(duì)儀器要求比較嚴(yán)格，現(xiàn)還不能普及到大多的實(shí)驗(yàn)室中，故本文采用氣相色譜法對(duì)動(dòng)植物油脂中的角鯊烯進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)油脂中成分較復(fù)雜，富含油脂類(lèi)和色素類(lèi)物質(zhì)，凈化困難，易造成對(duì)色譜系統(tǒng)的污染，故選用多孔凝膠為固定相的凝膠色譜凈化系統(tǒng)對(duì)油脂進(jìn)行凈化處理，去除色素和油脂，再結(jié)合氣相色譜對(duì)動(dòng)植物油脂中的角鯊烯進(jìn)行定量分析。本文旨在建立GPC-GC-FID色譜法測(cè)定動(dòng)植物油脂中角鯊烯的檢測(cè)方法，以期將其廣泛的應(yīng)用于動(dòng)植物油脂中角鯊烯含量測(cè)定分析中。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

角鯊烯純度99.5%；乙酸乙酯、環(huán)己烷色譜純；其他試劑均為分析純；11種食用油均來(lái)自市售食用油。

凝膠色譜儀、Bio Beads S-X3凈化柱（300mm× 25mm，38～75μm）美國(guó)J2 Scientific公司；Agilent 7890A氣相色譜儀（配氫火焰離子化檢測(cè)器）美國(guó)安捷倫公司；氮吹儀美國(guó)Organomation Associates Jnc；BSA224Sx型分析天平賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制精確稱(chēng)取角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品25.0mg，用環(huán)己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）定容至25m L，配制成1000μg/m L角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于冰箱4℃避光保存。分別精密移取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0m L標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為940μg·m L-1）于10m L容量瓶，將儲(chǔ)備液稀釋為9.40～940μg·m L-1濃度梯度，供繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線用。

1.2.2樣品處理精密稱(chēng)取食用油2.0g，用環(huán)己烷-乙酸乙酯混合溶液（體積比1∶1）定容至10m L；取定容溶液于10m L凝膠色譜（GPC）進(jìn)樣瓶中，注入5m L于GPC色譜儀，用環(huán)己烷-乙酸乙酯混合溶液（體積比1∶1）對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，流速為4.7m L/min，收集時(shí)間段為13～19min的洗脫液，將此洗脫液揮至近干，用正己烷定容至10m L，進(jìn)行氣相色譜測(cè)定。

1.2.3色譜條件色譜柱：DB1701（30m×0.32mm× 0.25μm）；柱溫：150℃維持2m in，再以10℃/m in升至250℃，維持18m in；汽化室溫度270℃；檢測(cè)器溫度300℃；分流比為10∶1，進(jìn)樣量：1μL；載氣：氮?dú)饬髁浚汉懔?.0m L·m in-1，氫氣流量：40m L·m in-1，空氣流量：450m L·m in-1，尾吹流量：45m L·m in-1。

2　結(jié)果與討論

2.1GPC色譜條件考察

凝膠滲透色譜是利用被分離物質(zhì)本身與雜質(zhì)間相對(duì)分子質(zhì)量的大小，能夠有效除去大分子油脂的雜質(zhì)，從而達(dá)到凈化食用油樣品的目的。由于角鯊烯無(wú)大共軛體系，紫外吸收較弱，不能單純的從凝膠色譜工作站判定角鯊烯的洗脫曲線，故采用手動(dòng)收集代替自動(dòng)收集。每隔0.5m in收集一次洗脫液，每次收集1.0m L，并對(duì)洗脫液進(jìn)行檢測(cè)；以時(shí)間為橫坐標(biāo)，響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，得到角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品與茶油樣品中角鯊烯的洗脫曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1，在此GPC條件下，角鯊烯出峰時(shí)間為13～19min，角鯊烯的回收率為86.6%，能滿足檢測(cè)要求。

2.2色譜行為

2.2.1色譜條件本文采用DB1701毛細(xì)管色譜柱和FID檢測(cè)器測(cè)定食用油中角鯊烯，由于毛細(xì)管柱柱效高，角鯊烯峰形以及分離效果良好，能夠滿足分析的要求。依照本實(shí)驗(yàn)方法得到角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品和茶油樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1　角鯊烯（a）和茶油（b）的凝膠色譜流出曲線Fig.1　The GPC chromatography curves of squalene（a）and camellia oil（b）

圖2　角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品（a）及茶油樣品（b）色譜圖Fig.2　The GC chromatograms of squalene standard solution（a）and camellia oil（b）

2.2.2線性范圍及檢出限本方法采用外標(biāo)法定量，角鯊烯在9.40～940μg·m L-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為y=2.0273c+5.0887，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9999。對(duì)于角鯊烯含量較高的樣品，如經(jīng)凈化處理后，濃度超出線性范圍，則可稀釋后再測(cè)定。

再將角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行不斷稀釋?zhuān)葱旁氡萐/N=3，直至峰高為噪音3倍時(shí)的濃度為檢出限，此時(shí)角鯊烯的濃度為0.5μg·m L-1；以樣品稱(chēng)樣量為2.0g計(jì)，角鯊烯的檢出限為5μg·g-1，除高于氣質(zhì)聯(lián)用法外，均低于文獻(xiàn)報(bào)道氣相色譜法的檢出限［11-15］。

2.2.3精密度實(shí)驗(yàn)精密取經(jīng)凝膠色譜凈化后的茶油樣品，注入氣相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，其平均峰面積為22.38，RSD為3.6%，可知本方法的精密度可靠。

2.2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取茶油樣品溶液，在室溫下放置，每小時(shí)進(jìn)樣一次，連續(xù)進(jìn)樣12h，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差考察穩(wěn)定性，其平均峰面積為22.72，RSD為4.1%，表明茶油樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取茶油（同一批）6份，按“1.2.2”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定角鯊烯含量并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，茶油樣品中角鯊烯平均含量為112.7μg·g-1，RSD為3.1%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6加樣回收實(shí)驗(yàn)精密稱(chēng)取6份茶油（同一批），每份1.0g，加入120μL角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度為940μg·m L-1），再按“1.2.2”項(xiàng)下方法處理，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1　The resultof recovery experiments

2.2.7樣品測(cè)定為了解市售動(dòng)植物食用油中角鯊烯的含量狀況，購(gòu)買(mǎi)了11種食用油樣品進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，對(duì)購(gòu)買(mǎi)的動(dòng)植物食用油樣品按“1.2.2”項(xiàng)下方法提取制備，在擬定的色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　動(dòng)植物食用油中角鯊烯含量測(cè)定的結(jié)果Table 2　The result of squalene in edible oils of plant and animal

由表2可知，11種動(dòng)植物食用油中均含有角鯊烯成分，其中橄欖油含量最高，其含量為4927μg·g-1，其次為魚(yú)油1115μg·g-1，除葵花籽油、小磨香油和芝麻油小于50μg·g-1，大部分食用油中角鯊烯的含量在50～300μg·g-1之間。針對(duì)目前國(guó)標(biāo)制定時(shí)間較早，其未把動(dòng)植物食用油中的角鯊烯含量指標(biāo)納入食用油等級(jí)和真假的判定中，故本文建議結(jié)合食用油國(guó)標(biāo)中各項(xiàng)指標(biāo)與角鯊烯的含量對(duì)動(dòng)植物食用油整體質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，有利于鑒別動(dòng)植物食用油的優(yōu)、劣及真、假。

3　結(jié)論

本文建立了凝膠色譜-氣相色譜（GPC-GC-FID）測(cè)定多種動(dòng)植物食用油中角鯊烯含量的方法，油樣經(jīng)環(huán)己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）萃取后，用凝膠色譜除去大分子的油脂，再采用氣相色譜法對(duì)其進(jìn)行定量分析，平均回收率為95.7%，RSD為3.0%，最低檢出限為5μg·g-1。該方法具有樣品前處理簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可應(yīng)用于食用油中的角鯊烯含量測(cè)定。

［1］吳時(shí)敏.角鯊烯開(kāi)發(fā)利用［J］.糧食與油脂，2001（1）：36.

［2］詹豪強(qiáng).海洋魚(yú)油中角鯊烯、DHA和EPA的化學(xué)合成［J］.四川化工與腐蝕控制，1999，2（2）：38-43.

［3］Laurence E，Johnc R，Angus M，etal.Potential of squalene as a functional lipid in foods and conmetics［J］.Lipid Technology，2002，12：104-107.

［4］周金熙，李曉玉，湯寶娣.角鯊烯的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)毒理學(xué)雜志，1990，4（2）：151-152.

［5］趙振東，孫震.生物活性物質(zhì)角鯊的資源及其應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2004，24（3）：107-112.

［6］楊婷，孫智達(dá)，謝筆鈞，等.糯米香茶中角鯊烯含量的RPHPLC測(cè)定［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2012（24）：61-63.

［7］陳全斌，程忠泉，楊建香，等.羅漢果種仁油中角鯊烯的高效液相色譜分析［J］.廣西科學(xué)，2006，13（2）：118-120.

［8］張欣，于瑞祥，楊瑞鈺，等.植物油中角鯊烯的提取與高效液相色譜法分析［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2013，28（5）：96-99.

［9］戴洋洋，馬文宏，鄭維君，等.氣相色譜氫火焰離子化檢測(cè)器測(cè)定魚(yú)油中的角鯊烯［J］.甘肅農(nóng)業(yè)，2013（23）：70-71.

［10］鄭德勇，凌宏有.福建油茶籽在成熟過(guò)程中重要成分動(dòng)態(tài)變化的研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2014，29（2）：36-43.

［11］謝勇，蘇素嬌，梁一池.氣相色譜法測(cè)定茶籽油中角鯊烯含量的研究［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33（1）：42-44.

［12］鐘冬蓮，湯富彬，沈丹玉，等.油茶籽油中角鯊烯含量的氣相色譜法測(cè)定［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2011，30（11）：104-106.

［13］張東生，薛雅琳，金青哲，等.油茶籽油中角鯊烯含量的測(cè)定［J］.中國(guó)油脂，2013，38（11）：85-88.

［14］張青齡.橄欖油中角鯊烯含量的氣相色譜/質(zhì)譜法分析［J］.福建分析測(cè)試，2011，20（3）：1-4.

［15］汪運(yùn)明，陳華勇，楊繼國(guó)，等.氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定茶油中角鯊烯含量［J］.食品工業(yè)科技，2011（6）：404-406.

［16］唐小紅，陳華勇，王永華，等.氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定深海魚(yú)油中角鯊烯含量［J］.油脂工程，2012（1）：50-53.

［17］毛多斌，賈春曉，孫曉麗，等.幾種功能性植物油中角鯊烯和維生素E分析［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2007，22（2）：79-83.

［18］耿樹(shù)香，寧德魯，張艷麗，等.不同品種及成熟度橄欖油中角鯊烯的檢測(cè)分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（3）：79-81.

Determ ination of squalene in edible oils of p lant and animalby gel permeation chromatography-gas chromatography method

WANG Li-ping，LIN Chen*，F(xiàn)ANG Jun，CAIDa-chuan，LIN Ze-peng，F(xiàn)ANG Li，WU Ling-tao，LIXue-ying
（Guangdong Provincial Public Laboratory of Analysis and Testing Technology，China National Analytical Center Guangzhou，Guangzhou 510070，China）

To estab lished the gel chromatog raphy-gas chromatog raphy（GPC-GC-FID）method for the assay of squalene in severaledib le oils of p lant and animal，the oils were extracted by cyc lohexane-ethyl acetate（1∶1，V/V），then purified by GPC to remove macromolecule grease，and then squalene was determ ined by gas chromatog raphy.Under the experimental cond ition，squalene showed a good linear relationship in the range of 9.40～940μg·m L-1，R2was 0.9999.The recovery was 95.7%，RSD was 3.0%.The method had the advantage in small sam p le matrix interference，high sensitivity，avoid ing contam ination instrument，could be w idely used in the analysis of squalene in ed ib le oils of p lant and animal samp le，which p rovided the basis for judging criteria of ed ib le oils of p lant and animalsam p le.

gel chromatography；gas chromatog raphy；edib le oils of p lantand animal；squalene

TS201.1

A

1002-0306（2015）06-0069-03

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.006

2014-06-05

王李平（1985-），碩士研究生，主要從事食品及藥品的安全質(zhì)量方面的研究。

林晨（1979-），碩士研究生，助理研究員，主要從事食品及保健品的安全質(zhì)量方面研究。

廣東省專(zhuān)業(yè)鎮(zhèn)中小微企業(yè)服務(wù)平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目（2013B091604003）。