歐文軍　羅秀芹　李開綿

摘 要 以木薯SC8和MS5供試材料，研究5 ℃低溫處理0、7、10、12和15 d對木薯組培苗葉片若干生理代謝指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：木薯種質(zhì)SC8和MS5在5 ℃低溫脅迫下，隨著脅迫時間的延長，葉片的相對電導(dǎo)率、可溶性糖、丙二醛含量呈不斷上升趨勢，而可溶性蛋白、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶活性呈先上升后下降的變化趨勢；低溫脅迫下，葉片的相對電導(dǎo)率與丙二醛含量和可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)，與超氧化物歧化酶活性和可溶性蛋白含量呈極顯著負相關(guān)；可溶性蛋白含量與丙二醛含量呈顯著負相關(guān)，與游離脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶活性呈極顯著正相關(guān)；超氧化物歧化酶活性與可溶性糖含量呈極顯著負相關(guān)，與過氧化物酶活性呈極顯著正相關(guān)；主成分分析顯示超氧化物歧化酶活性、可溶性蛋白、可溶性糖和相對電導(dǎo)率在第1主成分中占有最大的信息量，與木薯耐寒性關(guān)系密切，可作為評價木薯耐寒性強弱的主要生理指標(biāo)，其次是可溶性蛋白、丙二醛含量和過氧化物酶活性。綜合分析生理數(shù)據(jù)認為木薯MS5的耐寒性高于SC8，這為下一步從離體保存庫中直接采用組培苗方式進行大規(guī)模篩選耐寒種質(zhì)提供參考方法。

關(guān)鍵詞 木薯；葉片；低溫脅迫；生理指標(biāo)

中圖分類號 S537 文獻標(biāo)識碼 A

木薯（Manihot esculenta Crantz）又名樹薯、木番薯，系大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot P. Miller）植物，其塊根富含淀粉，有“淀粉之王”之稱，其單位面積食物的能量超過水稻、小麥、高粱和玉米，是人類（特別是熱帶非洲國家）主要的食糧，迄今已有4 000 a的栽培歷史[1]。木薯起源于熱帶美洲，喜高溫，不耐霜凍[2]。一年中有8個月以上無霜期，年平均溫度18 ℃以上地方均可栽培[3]。木薯發(fā)芽出苗最低溫度為14～16 ℃，最適生長溫度為25～29 ℃，在14 ℃時生長緩慢，10 ℃以下停止生長，光合作用最低極限溫度為14 ℃，最高為40 ℃[4]。當(dāng)溫度為0～4 ℃時，植株容易受到寒害；當(dāng)溫度<0 ℃時，植株體內(nèi)細胞活動幾乎停止，生長點被凍傷[5]。中國熱帶亞熱帶旱地資源達200萬hm2，可供開墾種植木薯的荒地達100萬hm2，隨著氣候變暖、抗寒品種選育和種莖越冬貯藏技術(shù)的逐步改善，中國木薯植區(qū)從目前北緯26°逐漸北移到27～30°，將現(xiàn)有木薯栽培面積約50萬hm2發(fā)展到100～150萬hm2[6]，但低溫傷害成為限制中國木薯北移的主要原因。2008年的低溫雨雪冰凍天氣給廣西木薯產(chǎn)業(yè)造成了前所未有的災(zāi)害[7-8]。目前，大多數(shù)學(xué)者對木薯耐寒性的研究采用地栽苗或莖桿盆栽苗等方式進行[9-12]，鮮有用組培瓶苗的方式進行評價。因此，探討木薯組培苗葉片在低溫脅迫下的代謝生理特性，比較耐寒性的強弱，將為直接采用組培苗方式對離體保存庫的木薯資源進行大規(guī)模篩選耐寒種質(zhì)提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為木薯SC8和MS5，來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所木薯研究中心離體保存實驗室。

1.2 方法

1.2.1 前處理方法 選取培養(yǎng)40 d的組培苗置于恒溫恒濕箱內(nèi)，在（25±1）℃、3 000 lx光照強度、16 h/8 h光照周期條件下將培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為按0.03 ℃/min降低至5 ℃，其他條件不變，取低溫處理0、7、10、12和15 d的組培苗葉片（含葉柄），測定相應(yīng)的生理生化指標(biāo)。

1.2.2 生理指標(biāo)測定 質(zhì)膜相對透性測定采用相對電導(dǎo)率法（REC）；可溶性蛋白含量（wSP）、游離脯氨酸含量（wPro）測定按李合生[13]研究的方法，可溶性糖含量（wSS）測定按朱政[14]研究的方法，丙二醛含量（wMDA）測定按高俊風(fēng)[15]研究的方法，超氧化物歧化酶活性（ASOD）測定按康俊梅[16]研究的方法，過氧化物酶活性（APOD）測定按孫文權(quán)[17]研究的方法，5項含量、2項活性指標(biāo)均以樣品鮮重（Fresh Weight， FW）為基數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2003對數(shù)據(jù)進行處理，利用SAS9.0軟件進行方差分析、新復(fù)極差測驗、相關(guān)性分析和SPSS19.0進行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對木薯組培苗REC的影響

由圖1可知，低溫脅迫對2個樣本的膜透性表現(xiàn)出隨著脅迫時間延長而呈增加的趨勢；處理7 d內(nèi)，2份樣本間REC差異不顯著，且均呈緩慢上升的趨勢；處理10 d開始，SC8的REC則極顯著的高于MS5；處理12 d后，REC均呈急劇上升，且2個樣本間的REC差距幅度進一步擴大；處理15 d時，SC8的膜透性是對照（0 d）的5.2倍；MS5的膜透性是對照（0 d）的3.0倍，可見低溫處理后木薯組培苗葉片的膜透性都遭到嚴(yán)重破壞，細胞內(nèi)物質(zhì)外滲比率明顯提高，隨著時間的延長，細胞膜受傷程度不斷加深，MS5與SC8之間的細胞膜穩(wěn)定性存在明顯差異，且MS5表現(xiàn)出低溫脅迫對細胞膜更好的保護性。

2.2 低溫脅迫對木薯組培苗wSP的影響

由圖2可知，低溫脅迫對2個樣本的wSP呈先上升后下降的趨勢，在5 ℃處理12 d時，wSP曲線出現(xiàn)拐點，然后明顯由上升轉(zhuǎn)為下降；在低溫處理過程中，2個樣本的wSP都先由高于對照，在出現(xiàn)拐點后慢慢低于對照；且MS5的wSP在同一處理時間內(nèi)均高于SC8；在處理12 d時，SC8和 MS5達到最大值，分別為42.73 mg/g和45.70 mg/g，是對照的1.07倍和1.12倍；處理10、12和15 d后，2個樣本的wSP均達到極顯著差異，說明wSP對低溫十分敏感；MS5增加wSP的能力顯著高于SC8，表現(xiàn)出對低溫脅迫更強的適應(yīng)性。

2.3 低溫脅迫對木薯組培苗wSS的影響

由圖3可知，在5 ℃低溫脅迫15 d，2個樣本的wSS曲線整體表現(xiàn)為上升趨勢；在0～12 d，葉片的wSS變化不明顯，但呈緩慢上升趨勢；低溫處理12 d后，wSS均呈急劇上升趨勢；在低溫處理15 d時，MS5的wSS 是對照的1.63倍，SC8的wSS是對照的1.45倍，此時MS5的wSS顯著高于SC8。表明低溫誘導(dǎo)了木薯組培苗葉片細胞內(nèi)可溶性糖含量的增加。在低溫條件下，不同木薯種質(zhì)間可溶性糖累積的速度和量存在差異。

2.4 低溫脅迫對木薯組培苗wPro的影響

由圖4可知，低溫脅迫對2個樣本的wPro影響呈現(xiàn)出先升高后降低的變化規(guī)律；低溫脅迫7 d內(nèi)，葉片的wPro幾乎無變化；在低溫脅迫7～10 d，葉片的wPro快速上升，低溫脅迫12 d時，2個樣本的wPro均達到峰值，達極顯著差異，其中MS5的wPro是對照的10.67倍，SC8的wPro是對照的3.40倍；低溫脅迫12 d后，2個樣本的wPro均呈急劇降低趨勢，但比對照高。表明低溫提高了木薯組培苗的wPro。在一定時間內(nèi)，低溫脅迫促進了木薯細胞內(nèi)wPro的升高；超過一定限度，低溫脅迫對脯氨酸的累積起負作用。

2.5 低溫脅迫對木薯組培苗wMDA的影響

由圖5可知，低溫脅迫對2個樣本的wMDA影響呈現(xiàn)逐步上升的變化趨勢；低溫脅迫7 d開始，SC8的wMDA急劇升高，到10 d后又轉(zhuǎn)而緩慢上升，處理15 d后含量達到38.17 nmol/g，是對照的1.61倍；而MS5幼苗葉片的wMDA在低溫脅迫7 d開始才緩慢上升，脅迫15 d后wMDA達到29.70 nmol/g，是對照的1.26倍；SC8的wMDA均高于MS5，且脅迫7 d開始，差異達極顯著，說明wMDA對低溫十分敏感。表明低溫處理前期（0～7 d）對木薯組培苗葉片內(nèi)wMDA影響不大，隨著脅迫時間的延長，wMDA迅速提高，這可能是由于過度的脅迫導(dǎo)致膜脂嚴(yán)重過氧化。MS5的wMDA低于SC8，增加也較SC8緩慢，說明MS5減慢了膜脂過氧化作用，對細胞膜保護作用較強。

2.6 低溫脅迫對木薯組培苗ASOD的影響

由圖6可知，低溫脅迫對2個樣本ASOD的影響表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢；處理7 d后，SC8的ASOD極顯著高于MS5；處理10 d后，MS5的ASOD極顯著高于SC8；處理12 d后，SC8的ASOD又反過來極顯著高于MS5；處理15 d后，2個樣品的ASOD差異不顯著。MS5在低溫脅迫10 d時其ASOD出現(xiàn)拐點，達到最大值58.62 U/（g·min），低溫脅迫15 d時降到21.47 U/（g·min）。SC8在低溫脅迫12 d時，ASOD出現(xiàn)拐點，達到最大值40.70 U/（g·min），脅迫15 d時降到21.37 U/（g·min）。低溫脅迫15 d時，MS5和SC8的ASOD低于對照，而處理10和12 d時，2個樣本的ASOD高于對照，表明ASOD對低溫十分敏感，低溫脅迫促使植物保持較高的ASOD來提高自身的防御力，而過長時間的脅迫，對整個SOD的防御系統(tǒng)造成嚴(yán)重損傷，導(dǎo)致酶活性迅速下降。

2.7 低溫脅迫對木薯組培苗APOD的影響

由圖7可知，低溫脅迫對2個樣本APOD的影響都出現(xiàn)先上升后下降的變化規(guī)律；處理7 d時，2個樣本的APOD上升均不明顯；處理10 d時，2個樣本的APOD均呈急劇上升，且MS5上升速率顯著高于SC8，此時2個樣本的APOD均達到峰值，分別為138.87和242.07 △OD/（g·min），此后2樣本的APOD又開始急速下降。處理10和12 d時，MS5的APOD均極顯著的高于SC8，但處理到15 d時，SC8的APOD極顯著的高于MS5，說明MS5的APOD對低溫更敏感。2樣本隨低溫脅迫時間不同，其POD活性均表現(xiàn)出差異極顯著，說明木薯的APOD對低溫十分敏感，一定時間內(nèi)，低溫脅迫使植物APOD保持較高水平，但過長時間的脅迫將嚴(yán)重抑制APOD。低溫脅迫下，不同木薯種質(zhì)的APOD響應(yīng)速度不一樣，MS5的APOD對低溫更敏感。

2.8 木薯葉片生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

由表1可知，wSP與REC、wMDA和wSS呈負相關(guān)，且與REC呈極顯著負相關(guān)，與wMDA呈顯著負相關(guān)，與wPro、ASOD和APOD呈極顯著正相關(guān)。ASOD與wSS呈極顯著負相關(guān)，與APOD呈極顯著正相關(guān)。REC與wMDA和wSS呈極顯著正相關(guān)，與ASOD和wSP呈極顯著負相關(guān)。說明植物在低溫脅迫下，可以通過降低細胞內(nèi)wMDA和wSS或提高ASOD和wSP來減少低溫對細胞膜透性的傷害，從而提高植物的耐寒性。

2.9 低溫脅迫對木薯葉片生理生化指標(biāo)的主成分分析

由表2可知，前3個主成分的累積貢獻率達到86.97%，基本綜合反映了2個木薯種質(zhì)耐寒性的絕大多數(shù)信息。因此，選取前3個主成分為主成分分析的依據(jù)并進行綜合評價。第1主成分的特征值為3.305，貢獻率為47.22%，因子負荷系數(shù)絕對值較大的依次為ASOD、wSP、wSS和REC（表3），因此第1主成分由ASOD、wSP、wSS和REC指標(biāo)決定。第2主成分的特征值為1.619，貢獻率為23.12%，以wPro和wMDA的負荷系數(shù)絕對值較大，因此第2主成分由wPro和wMDA決定。第3主成分的特征值為1.164，貢獻率為16.63%，其中以APOD的負荷系數(shù)絕對值最大，第3主成分由APOD決定。主成分分析結(jié)果（表3）顯示：木薯組培苗隨著低溫脅迫的加劇，細胞膜最先受到脅迫，膜脂過氧化作用加強，膜逐步被破壞，膜透性在不斷增大，丙二醛在細胞內(nèi)大量累積，植物通過提高抗氧化酶SOD、POD活性和細胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸的含量來降低低溫所造成的傷害，保護細胞膜透性從而提高植物的耐寒性。其中，ASOD、wSP、wSS、和REC在第1個主成分中占有最大的信息量，與木薯耐寒性關(guān)系密切，可作為評價木薯耐寒性的主要測試指標(biāo)。