張曦等

摘要[目的] 探討家蠶核型多角體病毒BmOrf99在桿狀病毒生命周期中的功能。[方法] 運(yùn)用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建BmOrf99缺失型重組病毒，研究BmOrf99對(duì)病毒復(fù)制、BV產(chǎn)生和病毒形態(tài)發(fā)生的影響。[結(jié)果]病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞1.5 h可檢測(cè)到BmOrf99表達(dá)；通過(guò)Red重組系統(tǒng)構(gòu)建敲除型病毒BmNPVBmOrf99KOpolhGFP，轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，敲除BmOrf99病毒仍能增殖復(fù)制，透射電鏡觀察顯示，BmOrf99敲除對(duì)病毒粒子裝配和多角體形成無(wú)明顯影響。病毒DNA轉(zhuǎn)染后24～72 h，敲除型病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清BV水平略高于對(duì)照病毒BmNPVBmOrf99WTpolhGFP；轉(zhuǎn)染后72 h，前者細(xì)胞培養(yǎng)上清TCID50略高于后者；轉(zhuǎn)染6～72 h，敲除型病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中病毒DNA水平高于對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；敲除型病毒感染72 h后，細(xì)胞中BmOrf98a表達(dá)水平比對(duì)照組提高2.21倍。[結(jié)論]BmOrf99為病毒早期基因，且復(fù)制非必需，缺失可促進(jìn)病毒DNA復(fù)制，略增加BV水平，但對(duì)病毒形態(tài)發(fā)生無(wú)影響，BmOrf99有可能通過(guò)調(diào)節(jié)病毒其他基因的表達(dá)而發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞家蠶核型多角體病毒；BmOrf99；敲除；BV；ODV

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）21-043-07

家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）屬于甲型桿狀病毒屬，具有囊膜包被的雙鏈環(huán)狀DNA，是主要寄生于節(jié)肢動(dòng)物的一類病原微生物[1]。BmNPV基因組序列測(cè)定由Gomi 等[2]于1999 年完成，其基因組DNA全長(zhǎng)128 413 bp，G+C含量占40%，含有136個(gè)潛在的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。BmNPV與苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）基因組結(jié)構(gòu)非常接近，比較BmNPV和AcMNPV的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)有115個(gè)ORFs（占基因組的78%）是高度保守的（同源性超過(guò)90%），同源ORFs之間的氨基酸序列同源性達(dá)93%[3]。在桿狀病毒感染復(fù)制周期中，能夠形成2種不同類型的病毒粒子，一種是獨(dú)特的非包涵體形態(tài)，核衣殼在細(xì)胞核內(nèi)形成后，通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜出芽時(shí)獲得囊膜，并釋放到細(xì)胞間質(zhì)中，即出芽型病毒粒子（budded virus，BV），另外一種在細(xì)胞核內(nèi)獲得囊膜的病毒最后被包埋在由多角體蛋白質(zhì)組成的包涵體內(nèi)，被稱為包埋型病毒粒子（occlusion derived virus，ODV）。病毒感染周期分為2個(gè)階段，包涵體在宿主腸內(nèi)的堿性蛋白酶裂解下釋放ODV，ODV感染細(xì)胞產(chǎn)生子代 BV，此為初級(jí)感染階段；產(chǎn)生的 BV繼續(xù)感染其他細(xì)胞和組織形成 ODV 和多角體，即為次級(jí)感染階段。

桿狀病毒與其他大型DNA病毒一樣，其基因表達(dá)具有時(shí)序性。根據(jù)表達(dá)時(shí)間順序可將基因分為立即早期基因、延遲早期基因、晚期基因和極晚期基因[4]，這些基因在調(diào)節(jié)病毒DNA復(fù)制、病毒基因的轉(zhuǎn)錄[5-6]、病毒RNA聚合酶組成[7]、病毒粒子的形成[8-9]和調(diào)控宿主基因表達(dá)[10]等方面發(fā)揮重要作用。推測(cè)約有50%數(shù)量的基因通過(guò)參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)、DNA復(fù)制和病毒粒子裝配等在病毒繁殖過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵作用；在病毒基因組中，還存在一些不參與病毒復(fù)制、表達(dá)和裝配的非必需基因，這些病毒非必需基因可能通過(guò)與其病毒或者宿主基因發(fā)生交互而發(fā)揮重要作用。在AcMNPV和BmNPV中，通過(guò)基因敲除構(gòu)建敲除型重組病毒已有許多基因的功能被研究，但有超過(guò)1/3的病毒基因功能仍未知[11]。

桿狀病毒基因組中存在一些小開放讀碼框（small open reading frame，sORF），編碼小于100個(gè)氨基酸殘基的小肽，其中桿狀病毒編碼的泛素可參與病毒粒子形成、病毒出芽增殖[12]、宿主細(xì)胞凋亡調(diào)控和宿主免疫系統(tǒng)調(diào)控[13]。BmNPV的BmOrf99基因位于基因組（GenBank登錄號(hào)：NC_001962.1）第94 540～94 725 nt區(qū)域，全長(zhǎng)僅186 bp，可編碼61個(gè)氨基酸，預(yù)計(jì)分子量為7 100 Da，但BmOrf99在病毒生活史中的作用仍不清楚。

為了探討B(tài)mOrf99可能的功能，筆者運(yùn)用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建了BmOrf99缺失型重組病毒，研究了缺失BmOrf99對(duì)病毒復(fù)制、BV產(chǎn)生和病毒形態(tài)發(fā)生的影響，發(fā)現(xiàn)BmOrf99為病毒早期基因，缺失后，對(duì)病毒的復(fù)制增殖、病毒增殖無(wú)明顯影響。

1材料與方法

1.1材料

含有能夠表達(dá)Red重組酶pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌BW25113菌株（BW21153/pKD46/Bac）和含有氯霉素抗性基因（cat）的pKD3質(zhì)粒由江蘇大學(xué)郭忠建副教授惠贈(zèng)，含有helper質(zhì)粒和BmNPV bacmid的大腸桿菌DH10菌株由蘇州大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，具有AcMNPV iel啟動(dòng)子控制的綠色熒光蛋白基因（egfp）和自身啟動(dòng)子控制的多角體基因（polh）的重組pFASTbPHGFP供體質(zhì)粒由蘇州大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2序列分析

BmOrf99基因序列來(lái)自BmNPV（T3株）（GenBank，NC001962），將GenBank中獲得的BmOrf99蛋白序列用BLASTp搜索引擎在GenBank/EMBL等數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找同源序列。結(jié)構(gòu)域利用在線軟件（http：//smart.emblheidelberg.de/）進(jìn)行分析。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用在線分析工具（http：//swissmodel.expasy.org）進(jìn)行。同源序列比較運(yùn)用在線軟件（http：//multalin.toulouse.inra.fr/multalin/）進(jìn)行?；诎被嵝蛄械南到y(tǒng)進(jìn)化樹使用MEGA5軟件中鄰接（NJ）法進(jìn)行分析構(gòu)建。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)

卵巢來(lái)源的BmN細(xì)胞以含10%胎牛血清（美國(guó)Gibco）的TC100液體培養(yǎng)基在27 ℃條件下培養(yǎng)。

1.4BmOrf99敲除型病毒Bacmid的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)Red重組系統(tǒng)原理設(shè)計(jì)一段同源序列對(duì)BmOrf99進(jìn)行敲除，該同源序列包含氯霉素抗性（cat）基因和一段48 bp的BmOrf99同源臂。以含有cat基因的pKD3質(zhì)粒為模板，以BmOrf99KO1/BmOrf99KO2為引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得同源序列；將該序列以電擊參數(shù)為2.5 kV電壓，200Ω電阻，25 μF電容進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入含有能夠表達(dá)Red重組酶的pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌BW25113感受態(tài)（BW21153/pKD46/Bac）細(xì)胞，電擊后立刻加入1 ml無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基37 ℃復(fù)蘇培養(yǎng)4 h，然后涂布培養(yǎng)于含氯霉素（Chl）（34 μg/ml）和卡那霉素（Kan）（50 μg/ml）的LB固體平板上。挑取克隆，并用BmOrf99KO引物對(duì)和Cat引物對(duì)（表1）進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將鑒定正確的重組Bacmid命名為Bm99KOBacmid。

1.5含有多角體基因和綠色熒光標(biāo)記基因的BmOrf99基因缺失Bacmid的構(gòu)建與鑒定

含有多角體基因和綠色熒光蛋白標(biāo)記基因的BmOrf99缺失型bacmid按如下步驟構(gòu)建：

①提取BmOrf99KOBacmid，電擊轉(zhuǎn)化菌株DH10，在含Kan、Chl的平板培養(yǎng)基上篩選，挑取轉(zhuǎn)化子用BmOrf99KO和CAT引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的菌株命名為BmOrf99KOBacmidDH10。

②pFASTbPHGFP供體轉(zhuǎn)化BmOrf99KOBacmidDH10感受態(tài)細(xì)胞，在含Kan、四環(huán)素（Tet，10 μg/ml）、慶大霉素（Gen，7 μg/ml）、IPTG（40 μg/ml）、Xgal（20 μg/ml）的平板培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落，用M13引物對(duì)（表1）進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的即為帶多角體基因和熒光蛋白標(biāo)記的BmNPVBmOrf99KOBacmid，命名為BmNPVBmOrf99KOpolhGFP。

1.6含有多角體基因和綠色熒光標(biāo)記基因的野生型Bacmid的構(gòu)建與鑒定

pFASTbPHGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10菌株，在含有Kan、Tet、Gen、IPTG、Xgal的平板上篩選，挑取白色菌落，用M13引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的Bacmid命名為BmNPVBmOrf99WTpolhGFP。

1.7重組病毒的構(gòu)建

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的家蠶BmN細(xì)胞鋪于細(xì)胞瓶或6孔板中，掌握細(xì)胞密度為1×105/ml，27 ℃培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞完全貼壁。取BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和 BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 各1 μg，與2 μl脂質(zhì)體混勻，轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞并于27 ℃培養(yǎng)，3 d后在綠色熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞發(fā)病情況，收集上清轉(zhuǎn)接正常BmN，收集上清，即成功獲得重組型病毒BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP。

1.8BmOrf99基因轉(zhuǎn)錄時(shí)相檢測(cè)

取3 μg重組質(zhì)粒BmNPVBmOrf99WTpolhGFP與脂質(zhì)體混合后轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞（5.6×105個(gè)），于轉(zhuǎn)染后0、1.5、3.0、4.5和6.0 h分別收集BmN細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，用DNase I（TaKaRa）消化，去除可能帶入的基因組污染，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度及濃度。取2 μg RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用BmOrf99特異性引物BmOrf99 RT1/BmOrf99 RT2（表1），按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：94 ℃ 1 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸2 min。以A3action基因作為內(nèi)參。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.9BV產(chǎn)量與TCID50測(cè)定

分別取BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 3 μg與脂質(zhì)體混合后分別轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞（5.6×105個(gè)），按轉(zhuǎn)后6、12、24、48、72和96 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心（5 000 r/min，5 min）去除細(xì)胞碎片。取轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清250 μl，利用viral DNA Kit（OMEGA）抽提試劑盒按說(shuō)明書所述步驟提取病毒DNA，用QBV1/QBV2為引物（表1）進(jìn)行qPCR定量檢測(cè)。反應(yīng)體系為：模板DNA 2 μl，SYBR Premix Ex Taq TM（TaKaRa）10 μl，引物0.5 μl （20 μmol/L），加H2O至總體積20 μl；反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min后，按 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)重復(fù)3次。同時(shí)，提取轉(zhuǎn)染BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 72 h后上清病毒DNA，并測(cè)定其OD值，將此DNA經(jīng)10倍梯度稀釋為模板進(jìn)行qPCR，根據(jù)qPCR結(jié)果，繪制病毒DNA濃度與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)一步根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同轉(zhuǎn)染時(shí)間細(xì)胞上清中的BV水平。

對(duì)病毒轉(zhuǎn)染6和72 h的細(xì)胞培養(yǎng)上清，進(jìn)一步通過(guò)終點(diǎn)稀釋法測(cè)定了TCID50。主要步驟為：將待測(cè)樣品用培養(yǎng)基作10倍梯度稀釋，制備不同稀釋度的病毒懸液，即10-1、10-2、10-3……10-9；在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，各孔細(xì)胞分別接種100 μl不同稀釋度的病毒懸液，每一個(gè)稀釋度的病毒設(shè)置8個(gè)重復(fù)。27 ℃培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變并記錄結(jié)果。按Reed和Muench兩氏法計(jì)算TCID50。以未轉(zhuǎn)染病毒的BmN細(xì)胞培養(yǎng)上清為對(duì)照。

1.10病毒DNA的復(fù)制分析

分別取BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 3 μg與脂質(zhì)體混合后分別轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞（5.6×105個(gè)），按轉(zhuǎn)后6、12、24、48、72和96 h收集細(xì)胞離心（5 000 r/min，5 min）去上清，用酚氯仿法抽提細(xì)胞總DNA。用于檢測(cè)病毒DNA復(fù)制的引物qPCRDF/qPCRDB可擴(kuò)增BmNPV gp41基因的部分序列（100 bp），該序列內(nèi)存在3個(gè)Dpn I酶切位點(diǎn)。因?yàn)镈pn I只能識(shí)別甲基化的位點(diǎn)，所以可利用Dpn I消除轉(zhuǎn)染的Bacmid DNA，而在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的病毒DNA不能被酶切。取從不同樣品中提取的總DNA 1.324 μg，用Dpn I酶切過(guò)夜，以酶切后的DNA經(jīng)10倍梯度稀釋為模板進(jìn)行qPCR檢測(cè)。qPCR的反應(yīng)體系：8 μl病毒DNA，10 μl SYBR Premix Ex Taq TM（TaKaRa），引物0.5 μl（20 μmol/L），補(bǔ)水至總體積為20 μl。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min后，按 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)重復(fù)3次。同時(shí)，將已知濃度的病毒DNA經(jīng)10倍梯度系列稀釋后為模板進(jìn)行qPCR，根據(jù)qPCR結(jié)果，繪制病毒DNA濃度與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)一步根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同轉(zhuǎn)染時(shí)間細(xì)胞內(nèi)的病毒DNA水平。

1.11透射電鏡觀察

為了探討B(tài)mOrf99基因的敲除對(duì)病毒形態(tài)發(fā)生的影響，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，用2.5%戊二醛4 ℃固定過(guò)夜。離心棄固定液，用0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min，洗去多余的戊二醛；用1%鋨酸溶液固定樣品1 h；倒掉固定液，用0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min；用梯度濃度（包括50%、70%、80%、90%、95%和100%）的乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15 min，再用純丙酮處理20 min；用包埋劑（環(huán)氧樹脂618）與丙酮的混合液（V/V=1∶1）處理樣品1 h后，再用包埋劑與丙酮的混合液（V/V=3∶1）處理樣品3 h，然后純包埋劑處理樣品過(guò)夜；將經(jīng)過(guò)滲透處理的樣品包埋起來(lái)，70 ℃加熱過(guò)夜，即得到包埋好的樣品。樣品在Reichert超薄切片機(jī)中制作超薄切片，切片經(jīng)過(guò)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液染色后，即可在日本JEOL公司的JEM1230型透射電鏡下以120 kV的電壓觀察超薄切片并拍照。

1.12敲除BmOrf99對(duì)其重疊基因BmOrf98a表達(dá)量的影響

在BmNPV基因組中BmORF99的3′端與BmOrf98a的3′端部分重疊，其ORF分別位于DNA的不同鏈上，為了分析敲除BmOrf99對(duì)其重疊基因BmOrf98a表達(dá)水平的影響，取BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 各10 μl分別感染BmN細(xì)胞（5.6×105個(gè)），于感染72 h后分別收集BmN細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，用DNase I（TaKaRa）消化，去除可能帶入的基因組污染，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度及濃度。分別取2 μg RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用BmOrf98a特異性引物BmOrf98a RT1/BmOrf98a RT2（表1），以A3action基因作為內(nèi)參。qPCR的反應(yīng)體系：2 μl cDNA，10 μl SYBR Premix Ex Taq TM（TaKaRa），引物0.5 μl（20 μmol/L），補(bǔ)水至總體積為20 μl。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min后，按 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1BmOrf99基因的序列分析

BmOrf99基因位于BmNPV基因組94 540～94 725 nt，該基因的ORF 為185 bp，編碼61個(gè)氨基酸，理論分子量為7 100 Da。結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)分析顯示，該蛋白含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，N端1～3氨基酸為膜外結(jié)構(gòu)域，4～23氨基酸為跨膜結(jié)構(gòu)域，24～61氨基酸為膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域；蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，BmOrf99的三級(jí)結(jié)構(gòu)有1個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)。

使用在線軟件對(duì)BmOrf99蛋白序列同源性進(jìn)行分析（圖1A），發(fā)現(xiàn)BmOrf99與中國(guó)野桑蠶NPV 的類Ac122蛋白、灰色尺蠖蛾NPV的假設(shè)蛋白和苜蓿丫紋夜蛾NPV的Ac122的同源性分別為98%、92%、90%，而與其他桿狀病毒的BmOrf99同源體的同源性較低?；诎被嵝蛄械倪M(jìn)化分析結(jié)果顯示，BmOrf99和中國(guó)野桑蠶NPV 的類Ac122蛋白親緣關(guān)系最接近（圖1B）。

2.2BmOrf99KOBacmid、BmNPVBmOrf99KOpolhGFP、BmNPVBmOrf99WTpolhGFP的鑒定

為了檢測(cè)BmOrf99基因是否通過(guò)Red重組被cat基因取代，用CAT引物對(duì)和BmOrf99KO引物對(duì)對(duì)BmOrf99敲除型病毒 bacmid進(jìn)行PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示，可分別擴(kuò)增出約500和1 100 bp的片段（圖2A），與理論值相符，說(shuō)明通過(guò)γRed同源重組技術(shù)已獲得Orf99缺失型bacmid（BmOrf99KOBacmid）。

nucleopolyhedrovirus）Orf99（GenBank登錄號(hào)：NP_047519.1）；Ac122like protein，野桑蠶核型多角體病毒（Bombyx mandarina nucleopolyhedrovirus）類Ac122蛋白（GenBank登錄號(hào)：YP_002884344.1）；hypothetical protein，灰色尺蠖蛾多角體病毒（Rachiplusia ou MNPV）的假設(shè)蛋白（GenBank登錄號(hào)：NP_703109.1）；AcOrf122 peptide，苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus）AcOrf122多肽（GenBank登錄號(hào)：NP_054152.1）；hypothetical protein（2），金翅夜蛾亞科核型多角體病毒（Thysanoplusia orichalcea nucleopolyhedrovirus）假設(shè)蛋白（2）（GenBank登錄號(hào)：YP_007250527.1）；DekiORF33，思茅松毛蟲核型多角體病毒（Dendrolimus kikuchii nucleopolyhedrovirus）ORF 33（GenBank登錄號(hào)：AFS51911.1）；hypothetical protein AGNV_gp120，大豆夜蛾核型多角體病毒（Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus）假設(shè)蛋白AGNV_gp120（GenBank登錄號(hào)：YP_803514.1）；hypothetical protein CFDNVgORF117，東部云杉色卷蛾DEF多樣核型多角體病毒（Choristoneura fumiferana DEF multiple nucleopolyhedrovirus）假設(shè)蛋白CFDNVgORF117（GenBanK登錄號(hào)：NP_932726.1）；hypothetical protein chmu038，歐洲云杉卷葉蛾桿狀病毒（Choristoneura murinana alphabaculovirus）假設(shè)蛋白chmu038（GenBank登錄號(hào)：YP_008992130.1）。

2為BmOrf99KO引物對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

B.BmNPVBmOrf99WTpolhGFP、BmNPVBmOrf99KOpolhGFP的PCR鑒定，M為DNA 1 kb Marker，3為BmNPVBmOrf99WTpolhGFP的M13引物對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4為BmNPVBmOrf99KOpolhGFP的 M13引物對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

C.野生型WTBacmid的PCR鑒定，M為DNA 1 kb Marker，5為野生型WTBacmid的M13引物對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

BmOrf99 KOBacmid電轉(zhuǎn)進(jìn)入DH10后獲得BmOrf99 KOBacmidDH10菌株，然后，再用pFastBacPHGFP轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落用M13引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果可擴(kuò)增出與理論值相符的5.5 kb的特異性條帶（圖2B），表明通過(guò)BactoBac系統(tǒng)已按試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得了具有多角體蛋白基因和GFP標(biāo)記的Orf99 缺失重組Bacmid BmNPVBmOrf99KOpolhGFP。同樣，用供體質(zhì)粒pFastBacPHGFP轉(zhuǎn)化含有野生型Bacmid的DH10B，通過(guò)篩選、鑒定獲得了具有多角體蛋白基因和GFP標(biāo)記的Orf99 非缺失型重組Bacmid BmNPVBmOrf99WTpolhGFP（圖2B），用M13引物對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定，可擴(kuò)增出5.5 kb的特異性條帶，而野生型Bacmid只可擴(kuò)增出300 bp左右的特異性條帶（圖2C）。

2.3BmOrf99基因表達(dá)時(shí)相分析

病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過(guò)qPCR檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染時(shí)間 BmOrf99的表達(dá)，結(jié)果顯示，病毒轉(zhuǎn)染1.5 h后就可以檢測(cè)到BmOrf99的表達(dá)，之后表達(dá)水平逐漸升高（圖3），表明Orf99是一個(gè)早期基因。

2.4BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和 BmNPVBmOrf99WTpolhGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光觀察

用BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和 BmNPVBmOrf99WTpolhGFP分別轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細(xì)胞，24 h后可觀察到少量細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，說(shuō)明GFP表達(dá)元件正確表達(dá)；48 h后，綠色熒光細(xì)胞數(shù)量明顯增加，部分細(xì)胞明顯變圓，72 h后，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，部分細(xì)胞上浮，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變。比較2種重組Bacmid轉(zhuǎn)染細(xì)胞引起的細(xì)胞病變，發(fā)現(xiàn)二者之間無(wú)明顯差異（圖4），說(shuō)明BmOrf99缺失后，病毒仍能增殖，BmOrf99為BmNPV復(fù)制非必需基因。

2.5BmOrf99敲除對(duì)BV產(chǎn)量的影響

為了檢測(cè)BmOrf99敲除對(duì)BV產(chǎn)量的影響，將已知濃度的病毒DNA經(jīng)10倍梯度系列稀釋后為模板進(jìn)行qPCR，繪制病毒DNA濃度與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5A），再進(jìn)一步根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算病毒DNA轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞上清中的BV水平。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染6～12 h ，培養(yǎng)細(xì)胞上清中的BV水平在BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP無(wú)明顯差異；轉(zhuǎn)染后24～72 h，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP

轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中的BV水平略高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP；96 h后BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞中BV水平差異不明顯（圖5B）；TCID50測(cè)定結(jié)果顯示，在BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP轉(zhuǎn)染6 h的培養(yǎng)細(xì)胞上清中，幾乎檢測(cè)不到病毒，而轉(zhuǎn)染72 h后，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清的TCID50略高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP（圖5C）。對(duì)2種重組病毒的TCID50進(jìn)行差異性分析，不存在顯著性差異（P>0.05）。

圖5BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP的BV轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中BV增長(zhǎng)曲線及TCID50

2.6BmOrf99敲除對(duì)病毒DNA復(fù)制的影響

將已知濃度的病毒DNA經(jīng)10倍梯度系列稀釋后為模板進(jìn)行qPCR，繪制病毒DNA濃度與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6A），再進(jìn)一步根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞中的病毒DNA水平。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染6～72 h，各個(gè)轉(zhuǎn)染時(shí)間點(diǎn)BmNPVBmOrf99KOpolhGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的病毒DNA水平均高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，至轉(zhuǎn)染后96 h，2種病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的病毒DNA水平?jīng)]有明顯差異（圖6B）。

2.7BmOrf99敲除對(duì)病毒形態(tài)發(fā)生的影響

BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞72 h后，用透射電鏡觀察病毒的形態(tài)發(fā)生。由圖7可見，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中可觀察到游離的完整病毒粒子，也可觀察到包埋進(jìn)多角體的病毒粒子，子代病毒的形態(tài)發(fā)生與BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP間并無(wú)異樣。

2.8BmOrf99敲除對(duì)其重疊基因BmOrf98a表達(dá)水平的影響

BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP感染細(xì)胞后，通過(guò)qPCR檢測(cè)BmOrf99敲除對(duì)其重疊基因BmOrf98a表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示（圖8），在感染72 h后，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP感染細(xì)胞中BmOrf98a表達(dá)水平比BmNPVBmOrf99WTpolhGFP感染細(xì)胞提高221倍，差異達(dá)到顯著水平（P值=0.004 6<0.05，t=7.671）。

3討論

BmOrf99為編碼61氨基酸的小ORF，同源搜尋結(jié)果顯示，在登錄的桿狀病毒全基因組序列中[14]，僅有8種桿狀病毒含有BmOrf99的同源基因；同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，BmNPV Orf99與野桑蠶NPV、灰色尺蠖蛾NPV、苜蓿銀紋夜蛾核NPV 的相應(yīng)蛋白有較高的同源性，與其他桿狀病毒的蛋白幾乎無(wú)同源性，暗示該基因并不是核型多角體病毒中的功能性保守基因，并不是不可或缺的[15]。

對(duì)BmOrf99基因起始密碼ATG上游序列的分析顯示，發(fā)現(xiàn)該基因既含有早期轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)CACT和TATA，同時(shí)也具有晚期轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)GTAAA，說(shuō)明BmOrf99既是一個(gè)早期轉(zhuǎn)錄基因也是一個(gè)晚期轉(zhuǎn)錄基因。BmOrf99基因的轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果顯示，在病毒轉(zhuǎn)染1.5 h后，就可以檢測(cè)BmOrf99轉(zhuǎn)錄，之后轉(zhuǎn)錄水平逐漸提高，該結(jié)果與BmOrf基因啟動(dòng)子區(qū)域序列分析結(jié)果相一致，推測(cè)BmOrf99可能參與病毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[16]。該研究的qPCR分析結(jié)果顯示，在病毒感染72 h后，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP感染細(xì)胞中BmOrf98a表達(dá)水平比BmNPVBmOrf99WTpolhGFP感染細(xì)胞提高221倍，推測(cè)BmOrf99對(duì)BmOrf98a基因表達(dá)有調(diào)控作用，BmOrf99可能通過(guò)調(diào)控病毒其他基因的表達(dá)而發(fā)揮作用。

為進(jìn)一步研究BmOrf99基因在BmNPV生命周期中的功能，運(yùn)用桿狀病毒BactoBac表達(dá)系統(tǒng)和Red重組系統(tǒng)構(gòu)建了一個(gè)BmOrf99敲除型重組病毒BmNPVBmOrf99KOpolhGFP。試驗(yàn)結(jié)果顯示，BmOrf99基因敲除后的重組病毒仍能增殖、轉(zhuǎn)染引起的細(xì)胞病變與野生病毒并無(wú)明顯差異，因此可以認(rèn)為BmOrf99為BmNPV復(fù)制非必需基因，缺失不影響病毒在BmN細(xì)胞間傳播。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，在BmNPVBmOrf99 KOBacmid轉(zhuǎn)染的BmN細(xì)胞中，病毒發(fā)生基質(zhì)、病毒粒子的形態(tài)發(fā)生和多角體對(duì)病毒的包埋均與野生病毒無(wú)明顯差異，表明BmOrf99缺失對(duì)病毒粒子及包涵體形態(tài)發(fā)生無(wú)影響。

BmNPV基因組約有30個(gè)可編碼100左右氨基酸殘基的小ORF，其中一些sORF功能已經(jīng)被探究，敲除ORF143發(fā)現(xiàn)病毒感染速度明顯降低，缺失Orf64基因嚴(yán)重影響病毒的感染性，而Lef10為病毒復(fù)制必需基因[11]。該研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24～72 h，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中的BV水平略高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP；轉(zhuǎn)染72 h后，前者TCID50高于后者，推測(cè)缺失BmOrf99有提高BV產(chǎn)量的傾向；轉(zhuǎn)染細(xì)胞中病毒DNA水平檢測(cè)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染6～72 h，各個(gè)轉(zhuǎn)染時(shí)間點(diǎn)BmNPVBmOrf99KOpolhGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的病毒DNA水平均高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，說(shuō)明缺失BmOrf99可提高病毒DNA的復(fù)制水平，缺失BmOrf99引起B(yǎng)V產(chǎn)量提高與病毒DNA的復(fù)制水平提高有關(guān)。

2012年Ono等運(yùn)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和Red重組系統(tǒng)，分別構(gòu)建了 BmNPV中141個(gè)基因的敲除型病毒，綜合分析了BmNPV基因組中基因在病毒間感染或病毒、宿主之間的相互作用，并按照敲除后不同的表現(xiàn)型將這141個(gè)基因分成4類[11]（A、B、C、D），其中A類特點(diǎn)是敲除掉目的基因后產(chǎn)生的子代病毒感染速率和對(duì)照組一樣，但GFP表達(dá)不如對(duì)照組。B類是敲除掉目的基因后產(chǎn)生的子代病毒感染速度明顯降低，這可能是由于子代病毒產(chǎn)量低或者產(chǎn)生的子代病毒感染性低，例如敲除Bm15、Bm65、gp41和Bm131基因。C類是敲除掉目的基因后產(chǎn)生的子代病毒在細(xì)胞間無(wú)感染性，但是細(xì)胞內(nèi)多角體仍能形成，這些基因在BmNPV形態(tài)發(fā)生上起到重要作用。例如lef1（Bm6）、lef2（Bm135）和dnapol（Bm53），它們?nèi)允荄NA復(fù)制所必需的[17-19]，而不是多角體蛋白表達(dá)所必需的。D類特點(diǎn)是敲除掉目的基因后GFP不表達(dá)也不能產(chǎn)生可感染性的子代病毒，這類基因參與病毒復(fù)制或作為病毒RNA聚合酶調(diào)控晚期基因表達(dá)[6，17-18]，在病毒復(fù)制和多角體蛋白形成方面起到必不可少的作用。而該研究結(jié)果顯示，BmOrf99敲除后，病毒DNA水平提高，BV產(chǎn)量有增加傾向，而病毒的形態(tài)發(fā)生無(wú)明顯變化，說(shuō)明BmOrf99與上述BmNPV的A、B、C和D 4類基因不同。

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