劉利彩 邢朝柱等

摘要 利用作物雜種優(yōu)勢生產(chǎn)雜交種的主要授粉控制系統(tǒng)是細胞質(zhì)雄性不育及其恢復系統(tǒng)。在雜交品種的選育過程中，優(yōu)良恢復系的準確選育至關重要。 主要綜述了棉花細胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)及恢復系的利用、遺傳方式、生理生化研究，育性恢復基因的遺傳定位，棉花細胞質(zhì)雄性不育及其育性恢復的分子生物學研究，以及棉花育性恢復基因的克隆和PPR基因家族的研究進展。

關鍵詞 棉花；育性恢復基因；遺傳定位；PPR基因

中圖分類號 S562 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）05-001-03

Research Progress on Cotton Cytoplasmic Male Sterility （CMS） and Fertility Restoring Genes

LIU Licai， XING Chaozhu*， WU Jianyong et al

（Institute of Cotton Research of CAAS/State Key Laboratory of Cotton Biology， Anyang， Henan 455000）

Abstract Cytoplasmic male sterility （CMS） and fertility restorer system is the main pollination control system in cotton heterosis usage. In the process of the breeding of hybrids， it is very important to select excellent restorer lines accurately. This article mainly reviewed the usage， the genetics， the physiological and biochemical studies of cotton CMS germplasm and restorer lines； Genetic mapping of fertility restoring genes； The molecular biology study on the cotton CMS and fertility restoration； As well as the cloning of cotton fertility restoration gene and the research progress of PPR gene families.

Key words Cotton； Fertility restoration gene； Genetic mapping； PPR gene

作者簡介 劉利彩（1988- ），女，河南濮陽人，碩士研究生，研究方向：棉花育性恢復基因。*通訊作者，研究員，博士，從事棉花雜種優(yōu)勢研究。

收稿日期 20141225

植物CMS是指植物不能產(chǎn)生正?；ǚ刍蛑划a(chǎn)生沒有活力的花粉，導致雄蕊不能正常授粉而雄蕊功能正常的一種母性遺傳現(xiàn)象。這種現(xiàn)象廣泛存在于高等植物中[1]。由于CMS育性能被恢復基因RF所恢復，是植物雜種優(yōu)勢利用的主要授粉控制系統(tǒng)。它已在水稻、油菜和玉米等主要作物雜交種選育中得到廣泛的利用[2]。

棉花具有十分明顯的雜種優(yōu)勢，而CMS育性在棉花雜交優(yōu)勢利用中還沒有大量應用。

這是因為在棉花中，有應用價值的雄性不育類型很少。由于雄性不育在雜種優(yōu)勢中的利用存在2個問題：一是核基因控制的不育系，其不育不易保持，即尚未找到真正意義上的完全保持系，制種時需要拔除50%的可育植株；二是質(zhì)核互作的細胞質(zhì)雄性不育系的恢復系恢復力不夠強，導致大量棉鈴脫落，并且?guī)в胁涣夹誀頪3-4]。開展哈克尼西棉細胞質(zhì)雄性不育育性恢復基因遺傳和定位研究，將為分子標記輔助選育優(yōu)良恢復系和分子檢測鑒定“三系”及其雜交種純度服務，也為進一步研究核質(zhì)互作的作用機理、克隆恢復基因打下基礎。

1 棉花細胞質(zhì)雄性不育系和恢復系的理論研究

1.1 棉花細胞質(zhì)雄性不育系及恢復系的利用現(xiàn)狀

美國是最早研究棉花CMS的國家。在20世紀60年代，Meyer[5]通過遠緣雜交的方法首次實現(xiàn)三系配套。Weaver等[6-7]經(jīng)過多年研究，發(fā)現(xiàn)哈克尼西棉不育胞質(zhì)會影響棉花產(chǎn)量。但是，經(jīng)過育種家長期的選育過程，不育胞質(zhì)對產(chǎn)量的不良影響已消除。在實際生產(chǎn)中，有利用價值的雄性不育系胞質(zhì)基礎主要有哈克尼西棉D2、D8和三裂棉。

我國對棉花CMS的研究開始于20世紀70年代[8]，目前主要有4種類型的細胞質(zhì)雄性不育系。僅哈克尼西棉、陸地棉、三裂棉胞質(zhì)的不育系能夠穩(wěn)定表現(xiàn)出穩(wěn)定的雄性不育特性，在雜交種生產(chǎn)上具有較高的利用價值。其中，陸地棉可以作為哈克尼西棉、陸地棉、三裂棉胞質(zhì)不育系的保持系[9]。2002年王學德等[10]利用農(nóng)桿菌介導法，篩選到一個強恢復系，被命名為“浙大強恢”。

國內(nèi)外已成功選育多個棉花CMS三系配套的三系雜交種，但是三系雜交棉選育進程緩慢。一些專家將其原因歸為：①棉花CMS胞質(zhì)類型單一；②恢復基因來源狹窄；③缺乏簡便高效的傳粉媒介，三系雜交棉種子生產(chǎn)過程中省略了人工去雄環(huán)節(jié)，但是授粉程序仍要人工輔助完成；④恢復系的恢復能力受溫度的影響。

1.2 棉花細胞質(zhì)雄性不育育性恢復的遺傳方式

在利用不育系進行三系雜交制種時，必須要有恢復系對其育性恢復?；謴拖档膹娀謴湍芰κ侵陵P重要的。因而，近年來加強了對恢復基因的研究，以期創(chuàng)制性狀良好、遺傳穩(wěn)定的強恢復系。

Meyer等[11]報道，育性恢復受2對獨立遺傳基因控制，其中一對是顯性基因（F-），另一對是純合隱性基因（ss）。Kohel等[6]研究則認為，哈克尼西棉CMS育性恢復僅受1對基因Rf控制，并首次發(fā)現(xiàn)了一個形態(tài)學標記基因Rc與Rf1連鎖，重組率為14.0%。王學德等[12]則認為，不育系受2個獨立遺傳的顯性基因Rf1和Rf2控制。2001年，Stewart等[13]研究認為，哈克尼西棉CMS系統(tǒng)受到1對獨立顯性基因（Rf2）控制，CMSD2Rf系統(tǒng)受到2對獨立遺傳的顯性基因（Rf1，Rf2）控制。李朋波等[14]以晉A為研究材料，發(fā)現(xiàn)恢復基因是由一個顯性基因控制的。曹秀霞[15]通過田間調(diào)查，統(tǒng)計了409株近等基因系群體單株和695株F2群體單株的育性分離情況，其中近等基因系中有223個可育株、186個不育株，F(xiàn)2群體中有502個可育株、193個不育株。經(jīng)卡方檢驗，結果表明，近等基因系群體中的可育株與不育株分離比例符合1∶1，在F2群體中分離比例符合3∶1。這說明哈克尼西棉育性恢復基因的遺傳是由1對顯性基因（Rf1）控制的。馮純大等[16]均認為不育系育性恢復受1對基因控制。

1.3 棉花細胞質(zhì)雄性不育的細胞學及生理生化研究

棉花CMS基因的表達時期主要在造孢細胞增殖期和小孢子母細胞減數(shù)分裂期，表達部位主要集中在絨氈層細胞和小孢子母細胞。王學德等對國內(nèi)6個胞質(zhì)不育系以及哈克尼西棉胞質(zhì)的敗育過程進行細胞學研究，發(fā)現(xiàn)這7種不育系的敗育原因大致分為2類：一是不育系的造胞細胞在增殖期敗育，出現(xiàn)異常不能進行正常的有絲分裂，導致花粉敗育；二是造孢細胞在增殖期沒有異常，但在減數(shù)分裂期敗育，而且所有不育系花藥的絨氈層細胞停止分裂生長，常常高度液泡化。

裴文鋒[17]通過對雄性不育系和保持系制作壓片進行細胞學觀察比較，發(fā)現(xiàn)可以確定哈克尼西棉胞質(zhì)不育系的敗育時期發(fā)生在減數(shù)分裂活動之前。裴文鋒進一步對雄性不育系和保持系進行石蠟切片觀察，發(fā)現(xiàn)初步判斷花粉母細胞減數(shù)分裂的粗線期是在花蕾3.1～3.6 mm時期，而不育系花粉母細胞敗育時期為粗線期之前，即判定敗育的發(fā)生期為2～3.1 mm。

與可育花粉相比，不育花藥的碳水化合物代謝變化有淀粉積累受阻，淀粉酶和同工酶缺失和酶活性降低，花藥細胞中缺少淀粉粒，花藥脂肪含量低，蛋白質(zhì)含量偏低，不育花藥中細胞色素氧化酶（COX）含量減少，活性降低。在棉花不育花藥的發(fā)育過程中，活性氧的積累過程以及花藥自身對其清除能力的降低是與小孢子母細胞死亡同步發(fā)生的。

2 細胞質(zhì)雄性不育恢復基因的遺傳定位

分子標記由于具有其他標記不可比擬的優(yōu)越性而被廣泛應用。目前在棉花細胞質(zhì)雄性不育育性恢復基因研究中，常用的分子標記有RFLP、RAPD、SSR、ESTSSR、STS、SCAR等。

Wang等[18]利用RAPD、AFLP、STS、CAPS和SSR標記技術發(fā)現(xiàn)了3個RAPD標記和1個SSR標記，并且推測出Rf1和Rf2都定位在D亞染色體組的LGD08 連鎖群（現(xiàn)命名為D5染色體）上。

曹秀霞[15]通過對構建的可育DNA池和不育DNA池進行多態(tài)性標記篩選。在8242對SSR引物中共發(fā)現(xiàn)13對SSR引物具有明顯多態(tài)性，用這13對引物再分別對近等基因系群體和F2 群體單株進行擴增，并且分別構建Rf1遺傳連鎖圖譜。通過比較連鎖圖譜和分析這些標記在棉花染色體上的位置，發(fā)現(xiàn)在研究中獲得的13個對于Rf1具有連鎖的SSR標記中，有7個標記位于第19染色體（又名D5染色體）上，進而推測，與這13個標記連鎖的與性恢復基因Rf1可能位于第19染色體上。

大量CMS恢復基因的定位研究表明，恢復基因座極有可能是以復合形式出現(xiàn)的。下面是一些相關研究的文獻證明。如，菜豆的恢復基因雖然擁有兩套完全不同的恢復機制，但是基因定位于同一基因位點上[19]；水稻中的WA型、BT型以及HL型3種CMS恢復基因均定位于相同位點[20]；同樣地，研究油菜育性恢復基因的學者發(fā)現(xiàn)油菜的nap和pol型2種CMS恢復基因也定位到同一個基因座上[21]的特殊現(xiàn)象，黑麥P型和G型CMS恢復基因與小麥T型不育恢復基因位于同一區(qū)域內(nèi)。

3 棉花CMS育性恢復的分子機理研究

自20世紀80年代以來，隨著分子生物學的發(fā)展以及植物基因組計劃的推動，越來越多的研究者通過對植物CMS育性恢復基因的分子水平研究，將CMS相關位點定位于線粒體。

線粒體基因組的重排、突變都可能引起植物敗育。在一些植物中已經(jīng)鑒定出與雄性不育有關的DNA片段。關于這些片段導致植物CMS發(fā)生的過程有2種觀點：一是毒害假說；二是能量假說。

馬勇[22]對在哈克尼西棉細胞質(zhì)不育系、保持系和恢復系間差異表達的256個基因進行AFLP擴增分析，最后對成功克隆、測序的85個差異表達序列片段序列進行Gene Ontology分析，發(fā)現(xiàn)這些差異性大片段主要參與能量代謝，防御，蛋白質(zhì)合成及運輸，信號轉導，分子伴侶等。而這些序列表達的異常都可能與敗育有關。

崔明暉[23]還利用RACE技術克隆不育系和保持系的atpA基因的cDNA全長，保持系序列可以編碼498個氨基酸的蛋白質(zhì)，而不育系序列可以編碼492個氨基酸的蛋白質(zhì)，序列比對相似性高達99.6%，推測其可能是由于個別堿基的突變或重組，導致編碼蛋白差異，進而導致雄性不育性的發(fā)生。

裴文鋒[17]以棉花細胞質(zhì)雄性不育系和保持系不同發(fā)育時期的花蕾為材料，分析miR156和預測的靶基因TBCC（Tublin binding cofactor C）在花蕾中的表達水平、相互關系。結果表明，不育系和保持系花蕾中 miR156表達量隨著花藥發(fā)育進程而顯著增加，TBCC在保持系中隨著花藥發(fā)育逐漸降低，而在不育系中該基因的表達水平一直維持在較低水平，推測不育性狀可能與TBCC的表達有關。

已證明一些恢復基因可通過改變線粒體不育相關基因的表達，恢復花粉育性?；謴突虻木唧w作用表現(xiàn)為恢復基因可以影響線粒體CMS基因的轉錄本穩(wěn)定性[24]，而且可以表現(xiàn)為組織專一性；恢復基因可以影響線粒體CMS基因的轉錄加工，影響CMS基因的表達。這是一種常見的Rf基因的作用形式。在玉米[25-26]、高粱[27]、水稻[28-29]細胞質(zhì)雄性不育的研究中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象。

綜上所述，對CMS恢復基因的作用方式可以分為2種。一是恢復基因抑制線粒體CMS基因的表達，二是恢復基因補償線粒體基因功能的缺陷。要想進一步搞清楚恢復基因的分子本質(zhì)及其具體的作用機制，就要科研工作者進行更深入地研究。

4 棉花育性恢復基因與PPR基因

4.1 棉花育性恢復基因的克隆

植物細胞質(zhì)雄性不育育性恢復機理的研究，還要依賴Rf基因的克隆?；蚩寺≈饕姓蜻z傳學途徑和反向遺傳學途徑2條途徑[30]。

克隆恢復基因是一項具有挑戰(zhàn)性的工作。由于沒有同源序列和蛋白序列的資料，常見的基因克隆策略難以應用；植物的育性恢復表型是通過恢復基因與胞質(zhì)不育因子共同作用的結果，使得恢復基因的突變分析變得復雜化。到目前為止，已克隆的植物Rf基因有玉米的Rf2基因[30]、矮牽牛的Rf基因[30]、蘿卜的Rfo和Rfk基因[31]以及水稻的Rf1基因[31]等。

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責任編輯 劉月娟 責任校對 李巖