王婧，張沂

（中國人民解放軍海軍總醫(yī)院，北京100048）

奧沙利鉑聯(lián)合熱療對胃癌耐藥細胞基因表達及增殖的影響

王婧，張沂

（中國人民解放軍海軍總醫(yī)院，北京100048）

目的觀察奧沙利鉑聯(lián)合熱療對胃癌耐藥細胞基因GST-π，survivin和P-gp表達及增殖的影響。方法體外培養(yǎng)人胃癌SGC7901/DDP細胞，取其生長對數(shù)時期待用。設(shè)置對照組、化學治療（簡稱化療）組、熱療組和熱化療組，并應(yīng)用流式細胞術(shù)（FCM）檢測每組中人胃癌細胞的增殖情況；采用FCM方法半定量檢測各細胞中GST-π，survivin和P-gp基因蛋白表達變化。將熱化療組置于37～43℃不同的恒溫箱中進行試驗，72 h后使用酶標儀檢測不同溫度的吸光度。結(jié)果熱化療可抑制GST-π，survivin和P-gp基因的表達，且抑制效果與外界溫度呈正相關(guān)；熱療和奧沙利鉑聯(lián)合熱療對人胃癌細胞SGC7901/DDP的增殖均有明顯的抑制作用；奧沙利鉑聯(lián)合熱療下降效果最明顯。結(jié)論熱療及奧沙利鉑聯(lián)合熱療均能抑制體外培養(yǎng)的人胃癌SGC7901/DDP細胞的增殖和表達，并能抑制該細胞的凋亡。腫瘤基因的表達與熱療溫度在37～43℃內(nèi)呈正相關(guān)。

熱療；奧沙利鉑；胃癌；耐藥細胞

隨著多藥耐藥（MDR）現(xiàn)象的出現(xiàn)，影響了化學治療（簡稱化療）對惡性腫瘤的療效。熱療又稱熏蒸，是治療癌癥患者的一種新方法。有研究發(fā)現(xiàn)，熱療和化療能協(xié)同作用于癌癥患者，且比單一化療效果更好，患者無瘤期更長［1］。本研究中通過對比奧沙利鉑聯(lián)合熱療對人胃癌耐藥細胞株的作用，并分析細胞增殖對GST-π，survivin和P-gp基因表達的影響，探索解決胃癌化療耐藥的新途徑，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃腺癌耐藥細胞株SGC7901/DDP（南京凱基生物有限公司），置RPMI1640培養(yǎng)液中，加入質(zhì)量濃度為1μg/mL的奧沙利鉑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號為8956542DC）用來維持耐藥性。兔抗人GST-π多克隆抗體、兔抗人survivin多克隆抗體和兔抗人P-糖蛋白（上海藍基生物科技有限公司）。

1.2 方法

分組：選擇培養(yǎng)液中生長對數(shù)期的細胞，通過常規(guī)胰蛋白酶消化后，以5.0×105/瓶接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h至細胞貼壁后，用含奧沙利鉑0.1μg/mL的RPMI1640培養(yǎng)基換液。注意先將熱療組和熱化療組在43℃恒溫水浴箱中加熱2 h后，再與對照組、化療組一起在37℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

流式細胞術(shù)（FCM）法檢測細胞周期分布和細胞凋亡：選取人胃癌耐藥株細胞對數(shù)生長期，應(yīng)用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，然后用生理鹽水洗滌2次，除去上清液，加油溴化丙啶1mL染色，立刻冰浴30min，用銅網(wǎng)過濾得到單細胞懸液，用流式細胞儀對細胞的DNA進行定量分析，計算出細胞周期的時相分布和凋亡率，按相應(yīng)的公式計算增殖指數(shù)（PI）［2］。

FCM法半定量檢測細胞的耐藥基因蛋白表達：選取對數(shù)生長期細胞，各組均重復(fù)3瓶取平均值。常規(guī)胰蛋白酶對細胞進行消化，用PBS液離心洗滌2次，用70%冷乙醇（4℃）固定。調(diào)整細胞濃度為1.0×106/mL，選取配好的單細胞懸液1mL，分別加入兔抗人GST-π多克隆抗體、兔抗人survivin多克隆抗體和兔抗人P-糖蛋白0.1mL（工作濃度1∶50），在室溫下孵育30min，再用PBS液洗3次；分別加入100μL羊抗兔IgG二抗工作液，室溫下避光孵育30 min，最后用PBS液洗3次后上機檢測。上機設(shè)定PBS為陰性對照，只加二抗作為本底對照［3］。以熒光指數(shù)（FI）作為表達蛋白的指數(shù)。平均熒光強度（均道值）=lg（測量值）×340。FI=實際樣品均道值/對照樣品均道值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖的比較

與對照組相比，化療組各細胞周期無明顯變化（P＞0.05）；熱療組和熱化療組在G0/G1期的細胞比例逐漸升高，而S期的細胞比例明顯降低（P＜0.05）；熱療組G2/M的細胞比例比對照組和化療組有所增加，但差異不具有顯著性（P＞0.05）；熱化療組相比其他各組各時期的細胞都有非常顯著的變化（P＜0.05）；化療組和熱化療組的PI相對對照組有所降低，但無明顯差異；熱化療組的PI明顯低于其他各組（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 細胞耐藥基因的表達

結(jié)果見表2。

2.3 熱化療與孵育溫度的關(guān)系

由表3可見，在對人胃癌細胞SGC7901/DDP熱化療72 h后，不同的熱療溫度下，人胃癌細胞株表達的GST-π，survivin和P-gp的量也各不相同，由整體趨勢可見，隨著熱療溫度的升高，耐藥基因表達的量在不斷減少，且不同溫度組間的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 4組細胞周期及PI變化比較（±s，%，n=3）

表1 4組細胞周期及PI變化比較（±s，%，n=3）

注：與對照組相比，①P＜0.05；與化療組相比，②P＜0.05；與熱療組相比，③P＜0.05。

組別對照組化療組熱療組熱化療組G0/G143.77±2.14 43.66±2.21 48.31±0.28①②61.09±1.59①②③S 40.17±0.81 40.31±0.69 34.49±1.48①②16.71±0.86①②③G2/M 15.78±2.54 15.93±3.01 17.29±1.75 22.13±2.29①②③PI 84.12±2.54 84.07±3.01 82.68±1.78 77.80±2.31①②③

表2 4組細胞FI值比較（±s）

表2 4組細胞FI值比較（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別對照組化療組熱療組熱化療組GST-π 1.000±0.000 1.012±0.021 0.749±0.020*0.398±0.059*survivin 1.000±0.000 1.013±0.019 0.721±0.013*0.648±0.019*P-gp 1.000±0.000 1.009±0.021 0.704±0.011*0.451±0.020*

表3 奧沙利鉑聯(lián)合熱療對人胃癌細胞作用72 h后耐藥基因表達的影響（±s）

表3 奧沙利鉑聯(lián)合熱療對人胃癌細胞作用72 h后耐藥基因表達的影響（±s）

溫度37℃38℃39℃40℃41℃42℃43℃P GST-π 22.21±4.72 20.56±3.94 18.79±5.21 17.16±5.17 14.84±5.13 12.94±5.24 11.54±5.11＜0.05 survivan 5.78±1.31 4.35±0.88 3.33±0.78 2.34±1.01 1.09±0.95 0.67±0.12 0.13±0.03＜0.05 P-gp 18.54±3.61 16.86±2.68 15.57±2.16 13.98±3.49 11.61±2.67 9.62±2.10 7.68±3.11＜0.05

3 討論

化療是手術(shù)外治療胃癌患者最重要的方法，隨著研究的深入，不同機制的MDR成為了腫瘤化療的一大難題［4］。熱療的作用機制是熱誘導(dǎo)細胞凋亡來殺傷腫瘤細胞，大量臨床觀察證實，熱療選擇性殺死腫瘤細胞在臨床治療時有重要價值［5］。在此基礎(chǔ)上，本研究中分析了熱療和熱化療對癌癥患者的不同效果。熱療的作用機制：腫瘤內(nèi)部血流速度慢、血流量低，在進行加熱后，腫瘤組織的溫度明顯升高，同時正常組織變化不明顯，可在不損傷正常組織細胞的前提下抑制腫瘤細胞；高熱量使腫瘤組織熱量聚集、pH降低、缺乏能量，直接損傷腫瘤細胞；高溫同時不適合腫瘤細胞中DNA，RNA及蛋白的合成；高溫可改變細胞結(jié)構(gòu)，不可逆地破壞腫瘤細胞的細胞器；溫度影響腫瘤細胞的生物膜，改變膜通透性；高溫提高機體免疫系統(tǒng)活性［6］。本研究結(jié)果顯示，熱化療比熱療效果更佳，作用機制為高溫加速腫瘤組織附近血液循環(huán)，滲透性升高使得化療藥物更容易進入細胞［7］；生物膜通透性隨著溫度升高而改變；高溫破壞了DNA分子結(jié)構(gòu)，減少癌細胞產(chǎn)生變異后代。

本研究結(jié)果顯示，熱療和熱化療均會造成G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M期細胞相對增多，同時熱化療作用效果最明顯。溫度在37～43℃時人胃癌細胞SGC7901/DDP的生長抑制作用隨溫度的升高而逐漸加強。與相關(guān)試驗的結(jié)論熱療可導(dǎo)致腫瘤細胞中MDR1，MDP1，GST-π的耐藥基因表達量大幅度減少［8-9］相符。

綜上所述，奧沙利鉑聯(lián)合熱療能抑制體外培養(yǎng)的人胃癌SGC7901/DDP細胞的增殖和表達，并能抑制該細胞的凋亡，為臨床熱療逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥提供了試驗依據(jù)。同時發(fā)現(xiàn)，腫瘤的表達基因與熱療溫度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。但腫瘤耐藥機制非常復(fù)雜，有很多的耐藥機制，需更多的試驗研究［10］。

［1］Zhang XL，Hu AB，Cui SZ，et al.Thermotherapy enhances oxaliplatin-induced cytotoxicity in human colon carcinoma cells［J］.World JGastroenterol，2012，18（7）：646-653.

［2］王琳，吳擁軍，劉新奎.熱化療聯(lián)合作用抑制人小細胞肺癌細胞增殖的機制［J］.腫瘤防治研究，2011，38（1）：1-4.

［3］趙大華，田東，于寧，等.胃癌組織中多藥耐藥基因產(chǎn)物LRP、GST-π、ToPoⅡ表達及臨床意義［J］.山東醫(yī)藥，2011，51（7）：58-59.

［4］劉剛，歐陽德群，趙勁風，等.HSV-TK自殺基因聯(lián)合熱療殺傷肝癌細胞系的實驗研究［J］.中國普通外科雜志，2013，12（8）：717-719.

［5］胡梅潔，袁耀宗，孫穎，等.胃癌多藥耐藥相關(guān)蛋白表達的臨床分析［J］.胃腸病學，2011，16（5）：293-297.

［6］阮新建，張俠，于忠和.奧沙利鉑聯(lián)合希羅達治療老年晚期胃癌的療效觀察［J］.中國藥業(yè)，2010，19（1）：41-42.

［7］于麗萍，李斌.多西他賽聯(lián)合雷替曲塞治療晚期胃癌的療效觀察［J］.中國藥房，2012，23（32）：3 009-3 011.

［8］李琳琳，馬銳，陳申，等.復(fù)方谷氨酰胺腸溶膠囊用于同步放化療

晚期胃癌的療效及安全性評價［J］.中國藥業(yè)，2014，23（24）：56-58.

［9］麻周萍，徐燕舞，鄭艷艷，等.護理干預(yù)對替吉奧聯(lián)合奧沙利鉑治療胃癌術(shù)后患者的效果評價［J］.中國藥業(yè)，2013，22（5）：80-81.

［10］李艷，章明放，郭雪西，等.胃腺癌中P-gp、ToPoⅡ、GST-π、MGMT和TS的表達及意義［J］.臨床與實驗病理學雜志，2011，27（11）：1 193-1 196.

R969.4；R979.1

A

1006-4931（2015）22-0078-03

王婧（1982-），女，大學本科，主管藥師，研究方向為醫(yī)院藥學，（電話）010-66957612。

2015-02-05；

2015-05-08）