王 玫　任 亮　孔 平　肇慧君　顏懷玉　楊春光

（遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連　116001）

牦牛絨DNA的提取及驗(yàn)證

王 玫任 亮*孔 平肇慧君顏懷玉楊春光

（遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連116001）

提取DNA是利用PCR技術(shù)檢測(cè)纖維的關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)。對(duì)牦牛絨DNA的提取方法進(jìn)行了試驗(yàn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明：使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 試劑盒，將纖維樣品盡量處理成粉末狀，并在樣品經(jīng)裂解液處理后先離心除去其中尚未完全溶解的纖維，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增是比較有利的，完全能夠得到滿足PCR擴(kuò)增要求的DNA樣品。

牦牛絨DNA提取方法驗(yàn)證

牦牛是高寒地帶的特有畜種，主要生活在海拔3000 m以上［l］。我國(guó)具有非常豐富的牦牛毛纖維資源［2］。牦牛絨主要作為紡織用高檔纖維原料；牦牛毛作為氈制品、繩索等低附加值產(chǎn)品原料，以及用于制作假發(fā)制品等。隨著生活水平的提高，人們對(duì)于天然真發(fā)制品的需求量越來(lái)越大，而有限的人發(fā)資源無(wú)法滿足，牦牛毛正成為其重要的替代原料。常見的牦牛絨制品有純絨產(chǎn)品，但混紡產(chǎn)品也占有一定比例。有些商家為了牟取利益，將混紡產(chǎn)品冠以“純牦牛絨”的桂冠，使消費(fèi)者上當(dāng)。摻進(jìn)了錦綸或粘膠纖維的產(chǎn)品，從外表光澤等方面很難辨別。利用PCR技術(shù)鑒別動(dòng)物纖維是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，而DNA的提取是利用PCR技術(shù)檢測(cè)纖維的關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)。

自1975年Bradfied等成功地從頭發(fā)中提取DNA以來(lái)，發(fā)毛已成為法醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)常用的檢測(cè)材料之一，它具有無(wú)創(chuàng)、取材痛苦性小、運(yùn)輸和儲(chǔ)存方便、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)［3］。已報(bào)道的獲可取DNA的樣品包括毛發(fā)、糞便、尿液、脫落羽毛、含口腔脫落細(xì)胞的食物殘?jiān)?、鱗片以及卵殼等［4］。毛發(fā)中的DNA主要集中在毛囊細(xì)胞中，毛干部分僅含有少量線粒體DNA［5］。在從動(dòng)物體上采集或脫落的毛發(fā)中，絕大多數(shù)都帶有完整的毛囊［6］。王慶林等研究表明從被毛毛囊細(xì)胞中提取DNA的最大缺點(diǎn)是獲得的DNA量非常少，如操作不慎，就有可能提取不到DNA［7］。毛干相對(duì)于毛囊，其DNA含量更少，幾乎所有成分都是角蛋白，但作為動(dòng)物組織，毛干具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如果提取方法得當(dāng)仍可以獲得一定量的DNA［8］。吳云良通過(guò)對(duì)細(xì)胞的煮沸和冷卻，使細(xì)胞破裂、蛋白質(zhì)變性，從而獲得用于PCR擴(kuò)增的模板DNA的法為提取東北虎毛發(fā)中DNA［9］。徐懷亮等提出一種快捷、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效、安全的有效的提取藏酋猴毛干中DNA的方法-納米磁珠法，并指出進(jìn)行毛發(fā)取樣時(shí)以5～10根較為合適［10］。目前，國(guó)內(nèi)從動(dòng)物毛皮中提取DNA的方法，主要采用經(jīng)典的DNA提取技術(shù)：蛋白酶K法裂解結(jié)合酚-氯仿抽提［11］；研究對(duì)象主要是一些珍稀動(dòng)物如小熊貓［12］、鬣羚［13］、麝科動(dòng)物［14］、揚(yáng)子鱷［15］等的陳舊毛皮標(biāo)本。雖然有關(guān)毛干DNA提取的報(bào)道已屢見不鮮，但由于毛干DNA含量低、髓質(zhì)層與皮質(zhì)層中含大量色素不易與DNA分離而抑制PCR擴(kuò)增等問(wèn)題［16，17］，常造成DNA提取、純化困難，導(dǎo)致分子生物學(xué)相關(guān)研究受到限制，影響下游工作。

關(guān)于牦牛絨DNA提取方面的報(bào)道較少，本文對(duì)牦牛絨DNA提取方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)與研究，采用PCR擴(kuò)增的手段對(duì)方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。

1　實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1試劑

實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T 6682中一級(jí)水的規(guī)格，組織和毛發(fā)提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（TaKaRa Code.9765），Premix Ex Taq?（Probe qPCR）（TaKaRa Code.RR390A），100%乙醇，DNA Laddar Marker。

1.2儀器與設(shè)備

冰箱：4℃～20℃，天平：感量0.000 1g，分析研磨機(jī)，剪刀，恒溫水浴鍋，離心機(jī)（12 000 rpm），渦旋混合器，微量可調(diào)移液器：0.1～2.5 μl，1～10 μl，2～20 μl，10～100 μl，20～200 μl，100～1 000 μl，1.5ml離心管，超凈工作臺(tái)，PCR儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，電泳裝置，凝膠成像儀。

2　實(shí)驗(yàn)方法與步驟

2.1取樣

從牦牛絨制品的不用部位取樣，共取約1 g試樣。

2.2制樣

用剪刀將樣品剪碎，經(jīng)分析研磨機(jī)打散混勻，再用剪刀盡量剪碎至2 mm以下，再次用分析研磨機(jī)混勻。

2.3DNA的提取

從混勻的樣品中稱取約5 mg試樣，放入2 ml離心管中，每個(gè)樣平行提取2管，加入 180 μl的 緩沖液GL（Buffer GL）、20 μl的蛋白酶K（Proteinase K）和10 μl的 核糖核酸酶A（RNase A）于 56 ℃水浴至組織完全裂解2h。如殘存纖維狀組織無(wú)法完全裂解，裂解之后先 12 000 rpm離心 2 min，去除雜質(zhì)之后再進(jìn)行后續(xù)操作。向裂解液中加入200μl緩沖液GB（Buffer GB）和 200μl 100%乙醇，充分吸打混勻。將 Spin Column 安置于 Collection Tube上，溶液移至 Spin Column中，12 000 rpm離心 2 min，棄濾液。將 500μl的緩沖液WA（Buffer WA）加入至 加入至ColumnSpin Column中，12 000 rpm離心1 min，棄濾液。將 700μl的緩沖液WB（Buffer WB）加入至 加入至ColumnSpin Column中，12 000 rpm離心1 min，棄濾液。重復(fù)一次，將 700μl的 Buffer WB加入至 加入至ColumnSpin Column中，12，000 rpm離心1min，棄濾液。將 Spin Column安置于TubeCollection Tube上，12，000 rpm離心2min。將Spin Column安置于新的 1.5 ml的離心管上，在 Spin Column膜的中央處加入35μl的滅菌水，室溫靜置 5min。12 000 rpm離心 2 min洗脫 DNA。以上操作中的Buffer GL、Buffer WA、Buffer WB以及Spin column、Collection Tube均來(lái)自寶生物工程（大連）有限公司TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒。

2.4引物探針信息

本文所用的引物和探針均由TakaRa寶生物工程（大連）有限公司合成，具體見表1。

表1　牦牛絨成分熒光定量PCR引物及探針

3　結(jié)果與分析

3.1DNA提取效果

DNA提取結(jié)束后對(duì)其進(jìn)行了DNA電泳以確保其DNA的提出，具體結(jié)果見圖1。由圖1 可見，提取的DNA擴(kuò)增條帶清晰，提取效果良好。

圖1　提取牦牛絨DNA電泳圖

3.2引物特異性驗(yàn)證

在優(yōu)化好的PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系下，以鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、山羊絨、牦牛絨、羊駝毛的DNA為特異性試驗(yàn)對(duì)照進(jìn)行PCR檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示，僅有牦牛絨被擴(kuò)增出條帶，而陰性對(duì)照未擴(kuò)增出條帶，證明牦牛絨引物的特異性良好，將其應(yīng)用于PCR方法，牦牛絨成分可以從其他纖維中有效地鑒別出來(lái)，具體結(jié)果見圖2。

圖2　PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

3.3檢測(cè)體系及結(jié)果

3.3.1反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

（1）PCR反應(yīng)體系：

以提取的牦牛絨DNA為模板，每次反應(yīng)均設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系25 μl，具體見表2。

表2　熒光定量PCR反應(yīng)體系

（2）反應(yīng)條件：

本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR初步反應(yīng)參數(shù)包括預(yù)變性、變性、退火延伸3步。實(shí)時(shí)熒光定量PCR初步反應(yīng)參數(shù)見表3。

表3　熒光定量反應(yīng)條件參數(shù)

ABI 7500 Fast Real Time System熒光定量PCR儀完全封閉操作，儀器可以直接讀數(shù)，熒光定量PCR熒光信號(hào)在每一循環(huán)延伸步驟完成后收集，并立即顯示出結(jié)果，可實(shí)時(shí)觀察每一循環(huán)收集熒光信號(hào)的強(qiáng)度。

3.3.2檢測(cè)結(jié)果

（1）Ct值及結(jié)果判定：

在優(yōu)化好的熒光PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系下，選擇鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、山羊絨、牦牛絨、羊駝毛的DNA為特異性試驗(yàn)的對(duì)照來(lái)進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，僅牦牛絨Ct值為24.412，而其他樣品及陰性對(duì)照無(wú)Ct值，結(jié)果及判定見表4。

表4　Ct值及結(jié)果判定

（2）熒光PCR檢測(cè)特異性試驗(yàn)結(jié)果：

在優(yōu)化好的熒光PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系下，選擇鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、山羊絨、牦牛絨、羊駝毛的DNA為特異性試驗(yàn)的對(duì)照來(lái)進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，僅牦牛絨有擴(kuò)增曲線，而其他對(duì)照以及空白對(duì)照均沒(méi)有擴(kuò)增曲線，表明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的特異性引物和探針與牦?；蚓哂休^高同源性，而與其他常見動(dòng)物物種的基因并沒(méi)有同源性，該檢測(cè)方法具較強(qiáng)的特異性。具體結(jié)果見圖3。

圖3　牦牛絨DNA熒光PCR結(jié)果

4　結(jié)論

使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 試劑盒提取牦牛絨DNA，經(jīng)檢測(cè)驗(yàn)證，DNA擴(kuò)增曲線良好，電泳條帶清晰單一，空白對(duì)照是陰性結(jié)果，引物對(duì)在其他幾種動(dòng)物纖維體系內(nèi)，包含鴨絨，鵝絨，綿羊毛，兔毛，山羊絨和羊駝毛，沒(méi)有擴(kuò)增。引物探針?lè)磻?yīng)性能和特異性良好，該試劑盒提取牦牛絨纖維DNA可以用于牦牛絨檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將纖維樣品盡量處理成粉末狀，并在樣品經(jīng)裂解液處理后先離心除去其中尚未完全溶解的纖維，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增是比較有利的，完全能夠得到滿足PCR擴(kuò)增要求的DNA樣品。

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國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目，（計(jì)劃編號(hào)2013 IK 112）

王玫（1968-），女，研究員，主要從事輕紡產(chǎn)品檢驗(yàn)技術(shù)研究。

任亮（1978-），男，工程師，主要從事輕紡產(chǎn)品檢驗(yàn)工作。