楊良月　常建華　曹曉東　吳樹清*　王新生，3　王 赫　王 喬　錢琳娜

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特　010018；

2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特　010031；

3.內(nèi)蒙古烏蘭察布市冷凍精液站，內(nèi)蒙古烏蘭察布　012000）

苦參堿制劑及其透皮制劑的皮膚刺激性試驗

楊良月1常建華2*曹曉東1吳樹清1*王新生1，3王 赫1王 喬1錢琳娜1

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；

2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010031；

3.內(nèi)蒙古烏蘭察布市冷凍精液站，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000）

目的：觀察苦參堿制劑和苦參堿透皮制劑作為外用藥的安全性。方法 根據(jù)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007年版），對家兔進行皮膚刺激性實驗。結(jié)果：苦參堿制劑對皮膚無刺激性；苦參堿透皮制劑對皮膚有輕度刺激。結(jié)論：苦參堿制劑及苦參堿透皮制劑外用安全。

苦參堿透皮劑皮膚刺激性

苦參堿最早是從苦參植物是從苦豆子中提取、分離、提純的一種單生物堿，國內(nèi)外調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)其具有抗寄生蟲和抑菌消炎作用，尤其對蠕蟲類1、原蟲類、體外寄生蟲均有良好的治療效果，前提為進一步探討臨床用藥的安全性和透皮劑對苦參堿透皮吸收的促進作用，設(shè)計了皮膚刺激性試驗，旨在研究苦參堿制劑經(jīng)皮給藥后在不影響抗寄生蟲的同時其的安全性問題。

1　試驗材料

試驗藥品：苦參堿透皮制劑，規(guī)格為500 ml∶25 g；苦參堿制劑，規(guī)格為500 ml：25 g，內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院提供，透明液體制劑；兩種藥用蒸餾水各稀釋100倍，避光保存待用。

試驗動物：日本大耳白兔12只，雌雄各半，體重2±0.5 kg，購自內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心。

2　試驗方法

2.1皮膚刺激性實驗

2.1.1單次皮膚刺激性實驗

2.1.1.1 試驗預(yù)處理

根據(jù)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007年版）的操作規(guī)程在試驗前24h用寵物脫毛器對背部兩側(cè)正常無破損區(qū)域進行脫毛處理，去毛范圍為 15 cm×15 cm。

2.1.1.2 試驗操作

分組：受試兔子隨機分為A組、B組兩組，每組6只；保定：助手對兔子進行手動保定；分區(qū)：將兔子背部右側(cè)定為對照區(qū)，左側(cè)定為試驗區(qū)，每側(cè)有前后2個區(qū)，前面為完整皮膚試驗區(qū)，后面為破損皮膚試驗區(qū)；實驗操作：破損皮膚試驗區(qū)用注射器針頭劃“井”字破口，破損區(qū)面積 1.5 cm×1.5 cm，劃痕間距 1 cm，以輕度滲血不傷及真皮為度。完整皮膚試驗區(qū)用記號筆標(biāo)記1.5 cm×1.5 cm區(qū)域。受試兔子隨機分為A、B兩組，每組6只，兔子右側(cè)每個受試區(qū)給予對照物蒸餾水 0.5 ml，左側(cè)每個受試區(qū)A組給予苦參堿制劑0.5 ml，B組給予苦參堿透皮制劑0.5 ml（使用前搖勻），用棉棒涂抹面積1.5 cm×1.5 cm，加2層紗布覆蓋保護，用膠布固定。每只兔子給予單獨籠子飼養(yǎng)。24 h 后用蘸有蒸餾水的紗布擦除受試物，溫水洗凈，分別于去除受試物后 10 min，20 min，1 h，2 h，24 h，48 h，72 h 觀察涂敷部位有無紅斑和水腫情況，以及上述變化的恢復(fù)時間和情況。根據(jù)表1、表2對結(jié)果進行處理分析。

2.1.2多次皮膚刺激性試驗

實驗動物準(zhǔn)備同單次皮膚刺激性實驗，每日涂抹藥量為0.5 ml，24 h后用蒸餾水清除殘留受試物并觀察病變，連續(xù)涂抹10 d。從第2 d開始，每次涂抹前剪毛，24 h后觀察結(jié)果，記錄每天紅斑及水腫情況（標(biāo)準(zhǔn)參照表1），并觀察涂抹部位是否有色素沉著、出血點、皮膚粗糙（或菲薄）情況，同時記錄其發(fā)生時間及消退時間。根據(jù)表1、表2對結(jié)果進行積分處理，結(jié)果見表3。

3　結(jié)果及評價

對參試動物皮膚變化進行病理觀察，結(jié)果詳見圖1和圖2。

圖1　單次給藥皮膚狀況攝影

圖2　長期給藥皮膚狀況攝影

從圖1可以看出，兔子背部正常皮膚與破損皮膚出現(xiàn)淡粉色輕微紅染，局部隆起。

從圖2可以看出，外觀可見皮膚紅腫，皮膚角質(zhì)層增厚，局部脫落。

圖3　長期試驗的透皮制劑組病理圖片

從圖3可以看出，病理組織觀察，角質(zhì)層增厚分層并逐漸脫落，真皮的纖維組織水腫導(dǎo)致纖維粗細(xì)雜亂真皮的纖維組織水腫導(dǎo)致纖維粗細(xì)不均，染色深淺不一，毛細(xì)血管內(nèi)充血。

單次給藥皮膚刺激性試驗，按照表 1 的評分標(biāo)準(zhǔn)計算每一觀察時間點各組受試物以及對照品皮膚反應(yīng)積分的平均分值，按表2 進行刺激強度評價。

表1　單次皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)

表2　單次皮膚刺激強度評價標(biāo)準(zhǔn)

單次皮膚刺激性實驗積分見表3

表3　單次皮膚刺激性實驗積分

3.1單次皮膚刺激性實驗結(jié)果

單次皮膚刺激性試驗中，對照區(qū)域皮膚無對照組無任何眼觀及病理變化；苦參堿制劑試驗組的完整皮膚實驗區(qū)無眼觀變化，破損皮膚實驗區(qū)有輕微紅腫現(xiàn)象，屬于皮膚破損后的正常反應(yīng)，觀察168 h后破損皮膚恢復(fù)完全，無紅腫、變厚、色素沉著等現(xiàn)象。病理切片觀察，無明顯病理變化。皮膚均分為皮膚積分為0，臨床用藥安全，基本無刺激性。

苦參堿透皮制劑組的完整皮膚實驗區(qū)在除去受試物1h開始出現(xiàn)紅腫反應(yīng)，在24 h內(nèi)紅腫反應(yīng)明顯，之后紅腫現(xiàn)象開始減輕，并紅腫逐漸消退，皮膚角質(zhì)層形成鱗片狀皮屑，120 h紅腫現(xiàn)象基本消失，受試部位仍然有局部增厚現(xiàn)象，皮屑逐漸脫落。240 h皮膚外觀無紅腫、變厚現(xiàn)象，無色素沉著，殘余部分皮屑。破損皮膚實驗區(qū)跟完整皮膚實驗區(qū)基本相同，皮膚愈合良好，眼觀未見鱗狀皮屑，無色素沉積。

3.2多次皮膚給藥刺激實驗結(jié)果

多次皮膚刺激試驗中，眼觀苦參堿制劑實驗組完整皮膚區(qū)和破損皮膚區(qū)無紅腫、變厚和色素沉著。與單次皮膚給藥反應(yīng)基本相同。病理切片觀察，表皮角質(zhì)層增生，輕微脫落，彈性纖維輕微水腫無斷裂，毛囊結(jié)構(gòu)正常。

苦參堿透皮制劑組的完整皮膚實驗區(qū)從第2 d開始出現(xiàn)紅腫、表皮及皮下組織增厚、可見用藥區(qū)域表皮隆起；第4天時開始出現(xiàn)鱗片狀皮屑，隨實驗的進行逐漸脫落，直到實驗結(jié)束。用藥區(qū)域無色素沉積。病理切片觀察，皮膚纖維組織水腫，分布間隙變大，有單核細(xì)胞浸潤。表皮的角質(zhì)層增生，分出多層，局部脫落，裸露出棘細(xì)胞層，棘細(xì)胞層變薄，棘細(xì)胞水腫；真皮纖維水腫斷裂，分布疏松，粗細(xì)不均，著色深淺不一，毛囊周圍小血管充血出血明顯，毛細(xì)血管上皮細(xì)胞水腫。

4　結(jié)論及討論

對照兩實驗組可見，添加透皮吸收劑的實驗組藥物對機體的刺激性比未添加透皮劑的組織刺激性大、藥物吸收多。根據(jù)病理切片觀察，紅腫部分主要有毛細(xì)血管充血紅腫部分主要由毛細(xì)血管充血、出血；真皮纖維層纖維水腫等原因造成。炎性細(xì)胞滲出較少。對照兩組破損皮膚區(qū)域，涂藥的破損皮膚的紅腫反應(yīng)相對較有輕微紅腫，無細(xì)菌感染，傷口恢復(fù)得也較快。證明苦參堿有抗炎、抗菌的作用。與周重楚（6）等人的研究相符。

實驗中單次給藥實驗中，未添加透皮吸收劑的實驗組單次及多次給藥實驗中，皮膚均無紅腫、變厚和色素沉著。證明苦參堿制劑在臨床上使用安全，無刺激性，與張在平［5］等人的實驗結(jié)果相符。而添加了透皮劑的實驗組輕微水腫、充血效果不明顯、角質(zhì)層輕微脫落，炎性細(xì)胞少量滲出較少，證明苦參堿可以刺激局部皮膚發(fā)生輕微水腫反應(yīng)，但刺激性不強。

對照長期試驗兩實驗組的病理切片，未添加透皮劑的皮膚炎性細(xì)胞浸潤較少，毛囊無任何病理變化；添加了透皮制劑的實驗組，纖維層的水腫斷裂、間隙變大；棘細(xì)胞層的細(xì)胞層數(shù)輕微增多、細(xì)胞水腫，但小血管的紅細(xì)胞滲出少。說明未添加透皮劑的皮膚藥物滲入皮膚的速度較慢、藥量較少，對皮膚的刺激是添加了透皮制劑皮膚病變的初期，對實質(zhì)組織的傷害極小，所以無任何眼觀病變，添加了苦參堿透皮制劑的皮膚由于吸收速度快，吸收量大迅速，所以刺激明顯，病變明顯。

本實驗在苦參堿制劑中添加透皮劑后，證明可以使藥物能更好地滲透進入皮膚內(nèi)，可提高藥物的生物利用度和藥效，但由于透皮制劑跟苦參堿制劑混合后為乳濁液，使用前需要充分混勻，下一步需要研究促進二者互溶的問題，使臨床用藥更加方便。

［1］ 蘇利波，張西臣.苦參抗寄生蟲的研究進展［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2008，（6）：471-473.

［2］ 鄒渭洪，付成效，畢津蓮，等.氮酮、丙二醇對濕疹噴霧劑中黃芩苷透皮吸收的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，（22）：32-34.

［3］ 孔福明.香妃夏露的皮膚刺激性和長期毒性試驗研究［J］.國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報，2006，12（18）：189-191.

［4］ 張在平，樊樹理，解國梁，等.苦豆子抑菌洗液皮膚刺激性研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，（3）：498-499，503.

［5］ 周重楚.苦豆子的抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)作用［J］.中國藥理學(xué)報，1989，10（4）：360.

楊良月（1988-），男，漢族，河北省邢臺市人。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院碩士研究生，主要研究方向為反芻動物抗病性能研究。

吳樹清（1957-），男，蒙古族，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，碩士生導(dǎo)師；常建華（1959-），男，漢族，內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學(xué)院研究員。

項目名稱：內(nèi)蒙古科技創(chuàng)新項目—苦參堿防治家畜外寄生蟲的研究。