莊 巖，夏文旭，雷晨瑤，肖宇軒，舒宗美，趙 萍，陸界瑾，聶 霖，牛 軍，王 雅

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

一株產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選、鑒定及酶性質(zhì)的研究

莊 巖，夏文旭，雷晨瑤，肖宇軒，舒宗美，趙 萍*，陸界瑾，聶 霖，牛 軍，王 雅

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

本文對(duì)從土樣中篩選出具有產(chǎn)脂肪酶的菌株Yz12進(jìn)行顯微鏡檢及分子鑒定，探索不同因素對(duì)菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響以及菌株Yz12酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，菌株Yz12最適溫度為30℃；最適pH為8.0；碳源為橄欖油與蔗糖（3∶1）；氮源為（NH4）2SO4與牛肉膏（1∶2）以及最佳發(fā)酵時(shí)間為72h。Yz12脂肪酶最適溫度為30℃；最適pH為7.0；Ca2+能促進(jìn)Yz12脂肪酶的活力。經(jīng)鏡檢及分子鑒定后，確定菌株Yz12為米曲霉Aspergillus oryzae。

菌株，脂肪酶，篩選，鑒定，酶活

Keywords∶ The raw coal sample； Heat of combustion； Determination； Renault correction plan

脂肪酶（Lipase）作為生物催化劑，是一類特殊酯鍵水解酶，隨著酶固定化技術(shù)等相關(guān)研究的突破進(jìn)展，人們對(duì)脂肪酶產(chǎn)生極大的興趣。盡管目前已經(jīng)克隆出低溫脂肪酶的部分功能基因并成功表達(dá)，但低溫脂肪酶基因的異源表達(dá)性能差限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用［1］。

微生物脂肪酶因具有種類多、制劑純度高等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，尤其在油脂化工和有機(jī)合成工業(yè)［2］。伴隨對(duì)生產(chǎn)脂肪酶微生物的深入研究，目前主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）、假絲酵母屬（Candida sp.）、黑曲霉（Aspergillus niger）、根霉屬（Rhizopus sp.）等。相對(duì)于來(lái)自動(dòng)植物的酶，微生物酶具有大規(guī)模發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，易于培養(yǎng)等特點(diǎn)［3］。隨著藥物蛋白臨床治療和工業(yè)酶應(yīng)用需求的日益增加，利用基因工程和蛋白質(zhì)工程來(lái)實(shí)現(xiàn)重組酶的高水平表達(dá)以及篩選出新特性或高活力的酶來(lái)滿足大規(guī)模純化酶的生產(chǎn)需求［4-5］，因此，能否大規(guī)模分離純化相應(yīng)的微生物酶制品已成為當(dāng)前生物工程中的一個(gè)關(guān)鍵性問(wèn)題［6］。

本研究通過(guò)采集蘭州理工大學(xué)學(xué)生食堂附近長(zhǎng)期積油的土壤，從積油土樣中分離篩選出產(chǎn)脂肪酶的菌株，進(jìn)行多次復(fù)篩及純化后，最終得到一株能產(chǎn)脂肪酶的高效菌株，并研究其產(chǎn)酶條件特性和酶學(xué)性質(zhì)。

1、材料與方法

1.1材料及培養(yǎng)基

試樣：采自于蘭州理工大學(xué)學(xué)生食堂附近長(zhǎng)期積油的土壤。

馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g，蔗糖（或葡萄糖）20g，瓊脂18g，水1000mL，pH7，1×105Pa滅菌30min。

羅丹明B顯色培養(yǎng)基：橄欖油2.0g、瓊脂粉5g、K2HPO40.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、（NH4）2SO40.4g至250mL蒸餾水，1×105Pa滅菌30min后加1mL 0.001mol/L羅丹明B。

油脂培養(yǎng)基：橄欖油2.0g、瓊脂粉5g、K2HPO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.1g、（NH4）2SO40.4g至250mL蒸餾水，1×105Pa滅菌30min。

復(fù)篩培養(yǎng)基：橄欖油3.0g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，（NH4）2SO41.5g，葡萄糖1.0g至150mL，1×105Pa滅菌30min。

1.2菌株Yz12的分離與純化

取采集土樣5.0g溶于10mL無(wú)菌水中，充分搖勻，靜置片刻，取上層液體1mL于20mL PDA液體培養(yǎng)基中，30℃，150r/min，培養(yǎng)3d后，取1mL轉(zhuǎn)接到新的PDA液體培養(yǎng)基中，同樣條件下進(jìn)行3次富集［7］。取最后一次富集菌液1mL到9mL無(wú)菌水中10倍稀釋到10-7，取各梯度1mL，分別涂布于羅丹明B顯色培養(yǎng)基和油脂培養(yǎng)基中，30℃，培養(yǎng)2-3d，將變色圈較大的菌落（羅丹明B顯色培養(yǎng)基，365nm）和透明圈較大的菌落（油脂培養(yǎng)基）劃線分離純化，挑至PDA斜面培養(yǎng)基上保藏［8］。將PDA斜面培養(yǎng)基上保藏的菌株，用無(wú)菌水配成并稀釋，將稀釋成10-2的菌懸液分別放入復(fù)篩培養(yǎng)基中，30℃，150r/min 培養(yǎng)60h后，采用滴定法測(cè)定脂肪酶酶活性［9］，選擇酶活最好的一株菌株，標(biāo)記為：Yz12。

1.3菌株Yz12顯微鏡檢及分子鑒定

制備PDA與油脂培養(yǎng)基，分別將菌株Yz12從斜面轉(zhuǎn)接到PDA和油脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)，并在3d后觀察其形態(tài)。參照《細(xì)菌鑒定手冊(cè)》與《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征初步檢測(cè)。

利用ITS rDNA兩端的引物NS1（GTAGTCATATGCTTGTCTC）和NS8（TCCTCCGCTTATTGATATGC）擴(kuò)增菌株Yz12的ITS rDNA基因，并進(jìn)行DNA測(cè)序。篩選得到的菌株Yz12的PCR擴(kuò)增及18S rDNA序列測(cè)序均由英茂盛業(yè)測(cè)序公司完成。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：基因組DNA 1.0μL、10×Buffer（含2.5mM Mg2+） 2.5μL、Taq聚合酶（5U/μL）0.5μL、dNTP（10mM）1.0μL、NS1（10μM） 0.5μL、NS8（10μM）0.5μL、ddH2O 0.5μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃ 3min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 120s，35個(gè)循環(huán)［10］。

利用CLC DNA Workbench 6軟件將獲得序列與GenBank中收錄的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，并與相關(guān)菌株構(gòu)建進(jìn)化樹。根據(jù)形態(tài)學(xué)與分子特征來(lái)確定菌株Yz12的屬種。

1.4各因素對(duì)菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響［11］

1.4.1溫度對(duì)菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響

將菌株Yz12轉(zhuǎn)接到裝有150mL復(fù)篩培養(yǎng)基的錐形瓶中，分別在30、35、40、45和50℃下，150r/min，培養(yǎng)60h，檢測(cè)其酶活力［12］。

1.4.2pH對(duì)菌株Yz12產(chǎn)酶的影響

將菌株Yz12轉(zhuǎn)接到裝有150mL復(fù)篩培養(yǎng)基的錐形瓶中，分別在pH為：5.0、6.0、7.0、8.0和9.0下，30℃，150r/min，培養(yǎng)60h，檢測(cè)其酶活力。

1.4.3碳源對(duì)菌株Yz12產(chǎn)酶的影響

將菌株Yz12轉(zhuǎn)接到裝有150mL在復(fù)篩培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，改變其不同的碳源｛碳源分別為：蔗糖4.0g、葡萄糖4.0g、可溶性淀粉4.0g、葡萄糖+橄欖油（1∶3）4.0g、蔗糖+橄欖油（1∶3）4.0g｝的錐形瓶中，30℃，150r/min，培養(yǎng)60h，檢測(cè)其酶活力。

1.4.4氮源對(duì)菌株Yz12產(chǎn)酶的影響

將菌株Yz12轉(zhuǎn)接到裝有150mL在復(fù)篩培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，改變其不同的氮源｛氮源分別為：（NH4）2SO41.5g、NH4Cl 1.5g、牛肉膏1.5g、蛋白胨1.5g、牛肉膏+（NH4）2SO4（2∶1）1.5g、蛋白胨+（NH4）2SO4（2∶1） 1.5g［13］｝的錐形瓶中，30℃，150r/min，培養(yǎng)60h，檢測(cè)其酶活力。

1.4.5發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株Yz12產(chǎn)酶的影響

將菌株Yz12轉(zhuǎn)接到含150mL復(fù)篩培養(yǎng)基的形瓶中，30℃，150r/min，分別培養(yǎng)36、48、60、72和84h，檢測(cè)其酶活力。

1.5菌株Yz12酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定［14］

1.5.1溫度對(duì)菌株Yz12酶活的影響

將含有10mL 0.01mol/L硬脂酸鈉與1g橄欖油的100mL乳化液（蒸餾水補(bǔ)足），加入5mL酶液后，分別在溫度為25、30、35、40、45℃，并在各反應(yīng)溫度的10、20、30min后，分別測(cè)定其酶活（3次重復(fù)，下同）。

1.5.2pH對(duì)菌株Yz12脂肪酶活力的影響

將含有10mL 0.01mol/L硬脂酸鈉與1g橄欖油的100mL乳化液（蒸餾水補(bǔ)足），加入5mL酶液后，分別在pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，30℃，并在各pH值條件下，反應(yīng)10、20、30min后，分別測(cè)定其酶活。

1.5.3金屬離子對(duì)菌株Yz12酶活的影響

取10mL 0.5mmol/L的Mg2+、Cu2+、Fe2+、K+和Ca2+溶液分別加入到100mL的乳化液和未加離子的反應(yīng)對(duì)照組中，加入5mL酶液，30℃，10min后，分別測(cè)定其酶活。

2、結(jié)果與分析

2.1菌株Yz12的鏡檢及18S rDNA基因鑒定結(jié)果

菌株Yz12在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌落質(zhì)地疏松，初白色，漸淡黃色，后為淡綠色至綠褐色；在油脂培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)緩慢，菌落呈黃綠色；分生孢子頭呈放射狀，直徑約為200μm。分生孢子梗莖約為2mm，近頂囊處直徑20μm左右，頂囊近球形小梗為單層，分生孢子呈球形（見圖1）。

圖1　Yz12 PDA培養(yǎng)基形態(tài)和棉藍(lán)染色后分生孢子形態(tài)（400X）Fig. 1 the morphology of the Yz12 in the PDA culture medium and the spores of the cotton blue staining （400X）

利用CLC DNA Workbench 6軟件將菌株Yz12的部分序列與GenBank中相關(guān)菌株的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建進(jìn)化樹（見圖2），同時(shí)根據(jù)GB/T 5009.22-2003中黃曲霉毒素B1的測(cè)定方法進(jìn)一步檢驗(yàn)菌株Yz12，最終確定該菌株為米曲霉Aspergillus oryzae。菌株Yz12的部分序列已提交至GenBank中，收錄號(hào)為JX489381。

圖2　菌株Yz12的18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析Figure 2 The analysis of sequence phylogenetic of 18S rDNA of strain Yz12

2.2各因素對(duì)菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響

2.2.1溫度對(duì)菌株Yz12產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，溫度20-30℃，菌株Yz12的產(chǎn)酶能力隨著溫度增加而增加，在30℃以后產(chǎn)酶能力逐漸降低，因此，認(rèn)為菌株Yz12的最適產(chǎn)酶溫度為30℃。經(jīng)鑒定，菌株Yz12為真菌，與細(xì)菌不同，溫度對(duì)真菌的產(chǎn)酶影響較大且發(fā)酵溫度在35℃以下比較適宜，產(chǎn)酶能力較好。

圖3　溫度對(duì)Yz12產(chǎn)酶的影響Figure 3 The influence of temperature on enzyme of Yz12

2.2.2pH對(duì)菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響

如圖4所示，培養(yǎng)基初始pH從5.0到9.0變化時(shí)，菌株Yz12起初產(chǎn)的酶能力隨著pH增加而增加，在8.0時(shí)開始趨于平緩，因此認(rèn)為菌株Yz12的最適產(chǎn)酶pH為8.0，說(shuō)明菌株Yz12在弱堿性條件下，有較好的產(chǎn)酶能力，這可能與菌株代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)影響脂肪酶合成，釋放有關(guān)，當(dāng)pH繼續(xù)增大時(shí)，產(chǎn)酶能力下降，這可能說(shuō)明高的pH不適應(yīng)這些菌株的生長(zhǎng)。

圖4　不同pH對(duì)Yz12產(chǎn)酶的影響Figure 4 The influence of different pH value of enzyme of Yz12

2.2.3碳源對(duì)菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響

在不同碳源組的檢測(cè)酶活中，蔗糖組酶活為5.89U/mL，葡萄糖組酶活為7.20U/mL，橄欖油組酶活為4.47U/mL，橄欖油+葡萄糖組酶活為9.65U/mL，橄欖油+蔗糖組酶活為10.25 U/mL，可溶性淀粉組酶活為8.24U/mL。以橄欖油為C源時(shí)，Yz12產(chǎn)酶活最低，而當(dāng)C源為橄欖油+蔗糖的混合時(shí)，產(chǎn)酶能力最高。一些研究指出以葡萄糖或蔗糖作為真菌產(chǎn)酶的C源可獲得理想的發(fā)酵效果［15］，而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)C源為油脂和蔗糖的混合時(shí)，效果明顯優(yōu)于葡萄糖、蔗糖等，這一現(xiàn)象可能與微生物種類不同和測(cè)試方法不同所致。

2.2.4氮源對(duì)菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響

檢測(cè)不同N源組酶活時(shí)，發(fā)現(xiàn)（NH4）2SO4組酶活為10.42U/mL，NH4Cl組酶活為10.27U/mL，牛肉膏組酶活為11.74U/mL，蛋白胨組酶活為9.43U/mL，（NH4）2SO4+牛肉膏組酶活為12.64U/mL，（NH4）2SO4+蛋白胨組酶活為11.22U/mL。N源是無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)氮時(shí)產(chǎn)酶能力相差不大，而當(dāng)N源為（NH4）2SO4+牛肉膏混合時(shí)，產(chǎn)酶能力最高。據(jù)報(bào)道，脂肪酶的發(fā)酵生產(chǎn)多以牛肉膏、蛋白胨為N源［8］，而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)N源為牛肉膏+無(wú)機(jī)氮時(shí)，產(chǎn)酶效果要好于牛肉膏或蛋白胨。

2.2.5發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響

如圖5可知，發(fā)酵時(shí)間從36-72h時(shí)，菌株Yz12的產(chǎn)酶能力隨著時(shí)間增加而增加，在72h時(shí)開始降低，因此，菌株Yz12的最佳產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間為72h。發(fā)酵時(shí)間越短，產(chǎn)酶能力基本與菌株的數(shù)量成正比，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)菌株趨于平穩(wěn)，脂肪酶產(chǎn)生速率最高，但隨著代謝不斷的進(jìn)行，酸性物質(zhì)產(chǎn)生，影響膜的通透性，同時(shí)也抑制酶的生成。隨著脂肪酶合成與釋放減少，脂肪酶被其他蛋白酶代謝，其數(shù)量逐漸降低［16］。

圖5　發(fā)酵時(shí)間對(duì)Yz12產(chǎn)酶量的影響Figure 5 The influence of fermentation time on enzyme production of Yz12

2.3菌株Yz12的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1溫度對(duì)菌株Yz12酶活的影響

由表1可知，菌株Yz12的脂肪酶最適溫度為30℃，溫度在35℃以下具有良好的穩(wěn)定性，溫度超過(guò)40℃時(shí)酶活活性快速下降。在45℃，30min后測(cè)定脂肪酶殘留活力僅初始反應(yīng)的20%左右。脂肪酶的熱穩(wěn)定性一直是脂肪酶生產(chǎn)和應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題，從自然界篩選高溫脂肪酶菌種并獲得對(duì)應(yīng)基因，應(yīng)利用基因克隆和重組等技術(shù)解決該問(wèn)題。

表1　溫度對(duì)Yz12菌株脂肪酶活力的影響（U/mL）Table 1 Effects of temperature on Yz12 lipase activity

2.3.2pH對(duì)菌株Yz12酶活的影響

由表2可知，菌株Yz12脂肪酶最適pH為7。隨后pH值增大，菌株Yz12的酶活迅速下降。在3個(gè)反應(yīng)體系中，pH在5.0-9.0中，菌株Yz12酶活都具有良好的穩(wěn)定性。pH的高低會(huì)影響到酶在溶液中的分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響酶的活性，其次研究的溶液極性大小對(duì)酶分子的結(jié)構(gòu)影響，能了解酶的催化特征，進(jìn)而有效利用酶的活性［17］。

表2　pH對(duì)Yz12脂肪酶活力和穩(wěn)定性的影響（U/mL）Table 2 Effects of pH on Yz12 lipase activity

2.3.3金屬離子對(duì)菌株Yz12酶活的影響

脂肪酶的催化一般不需輔助因子，但如Mg2+、Ca2+等二價(jià)金屬離子會(huì)對(duì)一些真菌脂肪酶有促進(jìn)作用。在不同離子組及對(duì)照組的檢測(cè)酶活中，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的酶活為10.81U/mL，Mg2+組的酶活為11.82U/mL，Cu2+組的酶活為9.53U/mL，F(xiàn)e2+組的酶活為9.15U/mL，K+組的酶活為11.02U/mL，Ca2+組的酶活為12.53U/mL，由此可知，Ca2+組能促進(jìn)菌株Yz12脂肪酶的活力；Mg2+、K+組比對(duì)照組稍高；Cu2+、Fe2+組比對(duì)照組稍低。

3、討論

3.1經(jīng)過(guò)選擇性培養(yǎng)篩選出有明顯白色水解圈和復(fù)篩測(cè)定酶活和觀察白色水解圈，獲得一株高效脂肪酶酶活菌株Yz12，結(jié)合微生物形態(tài)學(xué)與分子鑒定判定菌株Yz12為米曲霉Aspergillus oryzae。

3.2菌株Yz12最適產(chǎn)酶溫度為30℃；最適產(chǎn)酶pH為8.0；碳源為橄欖油與蔗糖（3∶1）、氮源為（NH4）2SO4與牛肉膏（1∶2）；最佳產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間為72h。

3.3菌株Yz12脂肪酶最適溫度為30℃，在35℃以下具有良好的穩(wěn)定性；最適pH 7.0，在pH 5.0-9.0時(shí)酶活較穩(wěn)定；Ca2+能促進(jìn)Yz12脂肪酶的活力。

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Isolation， identification and the enzyme properties research of a lipase producing strain

ZHUANG Yan， XIA Wen-xu， LEI Chen-yao， XIAO Yu-xuan， SHU Zong-mei， ZHAO Ping*，LU Jie-jin， NIE Lin， NIU Jun， WANG Ya（School of life science and engineering， Lanzhou University of Technology， Lanzhou， Gansu 730050， China）

To isolate and screen a strain Yz12 with high efficiency lipase from the soil sample， the isolation of Yz12 was carried out by microscopic examination and molecular identification. The influence of different factors on the production of Yz12 was studied， and the properties of Yz12 were determined. The most suitable temperature was 30. The optimal pH was 8. Carbon source was good for olive oil and sucrose （3∶1）， nitrogen source for ammonium sulfate and beef extract （1∶2）. The optimal fermentation time was 72h. Yz12 lipase activity was the most suitable temperature of 30. The best pH was 7. Ca2+ can promote the activity of Yz12 lipase. After microscopic examination and molecular identification， the strain Yz12 was identified as Aspergillus oryzae.

strains， lipase， screening， identification， enzyme activities

S154.39

A

甘肅省青年科技研究基金項(xiàng)目（1310RJYA022），國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAD15B03）

莊巖（1982-），男，講師，碩士，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)資源的開發(fā)與利用。

趙萍（1964- ），女，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)、副產(chǎn)物綜合利用研究，