夏凱，梁新樂，李余動(dòng)

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醋酸菌中CRISPR位點(diǎn)的比較基因組學(xué)與進(jìn)化分析

夏凱，梁新樂，李余動(dòng)

浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310018

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種廣泛存在于細(xì)菌和古菌中，能夠應(yīng)對(duì)外源DNA干擾(噬菌體、病毒、質(zhì)粒等)，并提供免疫機(jī)制的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)。CRISPR系統(tǒng)通常由同向重復(fù)序列、前導(dǎo)序列、間隔序列和CRISPR相關(guān)蛋白組成。本研究以醋酸發(fā)酵中常見3個(gè)屬醋桿菌屬()、葡糖醋桿菌屬()和葡糖桿菌屬()的48個(gè)菌株為研究對(duì)象，通過其基因組上CRISPR相關(guān)基因序列的生物信息學(xué)分析，探索CRISPR位點(diǎn)在醋酸菌中的多態(tài)性及其進(jìn)化模式。結(jié)果表明48株醋酸菌中有32株存在CRISPR結(jié)構(gòu)，大部分CRISPR-Cas結(jié)構(gòu)屬于type I-E和type I-C類型。除了葡糖桿菌屬外，葡糖醋桿菌屬和醋桿菌屬中的部分菌株含有II類的CRISPR-Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)(CRISPR-Cas9)。來(lái)自不同屬菌株的CRISPR結(jié)構(gòu)中重復(fù)序列具有較強(qiáng)的保守性，而且部分菌株CRISPR結(jié)構(gòu)中的前導(dǎo)序列具有保守的motif (與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān))及啟動(dòng)子序列。進(jìn)化樹分析表明適合用于醋酸菌株的分類，而不同菌株間基因的進(jìn)化與重復(fù)序列的保守性相關(guān)，預(yù)示它們可能受相似的功能選擇壓力。此外，間隔序列的數(shù)量與噬菌體數(shù)量及插入序列(Insertion sequence, IS)數(shù)量有正相關(guān)的趨勢(shì)，說(shuō)明醋酸菌在進(jìn)化過程中可能正不斷受新的外源DNA入侵。醋酸菌中CRISPR結(jié)構(gòu)位點(diǎn)的分析，為進(jìn)一步研究不同醋酸菌株對(duì)醋酸脅迫耐受性差異及其基因組穩(wěn)定性的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

醋酸菌；CRISPR；重復(fù)序列；遺傳進(jìn)化

醋酸菌隸屬于α變形桿菌綱，紅螺菌目，醋酸桿菌科[1]。醋酸菌一般可以從水果、花卉以及發(fā)酵食品中分離獲得，由于其能在乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的作用下將乙醇氧化為乙酸，因而在醋的工業(yè)化生產(chǎn)過程中扮演著非常重要的角色[2]。截止到目前，醋酸菌主要包括12個(gè)屬，其中研究最多的是醋酸桿菌()、葡糖醋桿菌()及葡糖桿菌()。醋酸桿菌和葡糖醋桿菌擁有較高的耐酸性因而被廣泛地用于醋的發(fā)酵[3]。醋酸菌容易受到外源DNA的干擾，特別是噬菌體的侵染。雖然噬菌體在基因水平轉(zhuǎn)移和遺傳多樣性方面發(fā)揮著重要作用，但在實(shí)際的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，噬菌體的浸染將會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。另外，噬菌體的侵染也造成了醋酸菌基因組的不穩(wěn)定，進(jìn)而影響到菌種的性能[5]。為了抵御來(lái)自外源DNA的干擾，特別是噬菌體、病毒以及質(zhì)粒，自然界的細(xì)菌在進(jìn)化過程中形成了一系列的防御機(jī)制，包括流產(chǎn)性感染、表面排斥以及限制性調(diào)節(jié)系統(tǒng)等[6]。CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種廣泛存在于細(xì)菌和古菌中，能夠應(yīng)對(duì)外源DNA干擾并提供免疫機(jī)制的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)[7]。因此，醋酸菌中CRISPR結(jié)構(gòu)位點(diǎn)的分析對(duì)于研究醋酸菌耐酸能力差異的遺傳機(jī)制具有重要的意義[8]。

CRISPR系統(tǒng)發(fā)揮作用主要分為3步：第一步是適應(yīng)階段，通過將外源核酸片段整合到CRISPR位點(diǎn)形成新的間隔序列；第二步是合成CRISPR RNA (crRNA)；最后一步是干擾，在crRNA的指引下Cas核酸酶可以將特定新侵入的外源核酸同源片段序列切割[9]。根據(jù)CRISPRdb[10]數(shù)據(jù)庫(kù)的統(tǒng)計(jì)信息，目前已報(bào)道的細(xì)菌和古菌的基因組序列中約45%的細(xì)菌基因組和83%的古菌基因組中都含有CRISPR結(jié)構(gòu)。一般微生物中CRISPR結(jié)構(gòu)的數(shù)量有1~2個(gè)，而多可達(dá)10或30個(gè)[9]。CRISPR系統(tǒng)主要由同向重復(fù)序列 (Direct repeat, DR)、前導(dǎo)序列(Leader sequence)、間隔序列(Spacer sequence)和CRISPR相關(guān)(CRISPR- associated, Cas)蛋白組成[11]。一般來(lái)說(shuō)，CRISPR-Cas系統(tǒng)及其各個(gè)組分在不同微生物基因組中的數(shù)量、基因序列、出現(xiàn)的頻率以及大小等方面具有較高的變異[12]。Makarova等[13]根據(jù)基因的結(jié)構(gòu)排列順序，將CRISPR-Cas系統(tǒng)主要分為3個(gè)大類型type I (含有和), type II (含有)和type III (含有)以及10個(gè)亞類型(I-A、I-B、I-C、I-D、I-E、I-F、II-A、II-B、III-A和III-B)[13]。

重復(fù)序列的長(zhǎng)度在不同物種中差別較大，而在同一物種中保守性較高[14]。一般重復(fù)序列的長(zhǎng)度為23~55 bp，重復(fù)序列中存在著短的回文序列，可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。間隔序列長(zhǎng)度一般為21~72 bp，間隔序列來(lái)自外源核酸DNA，具有很高的多態(tài)性，有時(shí)在同一種的不同菌株之間也會(huì)出現(xiàn)差異[9]。間隔序列的重復(fù)數(shù)在不同的菌種中差異明顯，據(jù)統(tǒng)計(jì)最高的重復(fù)數(shù)可以達(dá)到588 ()，但一般都在50以下，較低的只有2。前導(dǎo)序列在CRISPR結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著重要的作用，其通常位于CRISPR結(jié)構(gòu)第一個(gè)重復(fù)序列的上游一段AT富含區(qū)域，該段區(qū)域在不同物種間的保守性不高[15]。研究發(fā)現(xiàn)，新插入的間隔序列總是會(huì)加在前導(dǎo)序列和第一個(gè)重復(fù)序列之間[16]。同時(shí)由于前導(dǎo)序列的特殊結(jié)構(gòu)，前導(dǎo)序列通常含有下游重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子[17]?；蛭挥贑RISPR結(jié)構(gòu)中重復(fù)序列的上游或下游區(qū)域，據(jù)Daniel等的研究，目前共有45個(gè)基因家族，并大致可分為8個(gè)亞型，每個(gè)亞型均由該亞型特定的基因組成[18]。另外，有6個(gè)基因()與大多數(shù)不同亞型的基因相關(guān)聯(lián)，被認(rèn)為是核心基因，尤以為CRISPR結(jié)構(gòu)的標(biāo)志性基因[18]。研究表明，CRISPR系統(tǒng)中基因和重復(fù)序列相互關(guān)聯(lián)起作用，存在協(xié)同進(jìn)化現(xiàn)象[19]。

目前有關(guān)細(xì)菌CRISPR結(jié)構(gòu)的研究主要集中在大腸桿菌()、乳酸菌()、嗜熱鏈球菌()等[20]，但有關(guān)醋酸菌基因組中CRISPR結(jié)構(gòu)的分析未見有相關(guān)報(bào)導(dǎo)?，F(xiàn)有研究表明[1]，醋桿菌基因組序列中存在大量的前噬菌體DNA和轉(zhuǎn)座子，導(dǎo)致醋桿菌基因組的不穩(wěn)定性。與醋桿菌相比，葡糖桿菌和葡糖醋桿菌的基因組序列中含有較少的前噬菌體DNA序列，推測(cè)可能與其基因組中的CRISPR結(jié)構(gòu)及數(shù)量有關(guān)。本文對(duì)醋酸菌中的CRISPR結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析，探索CRISPR位點(diǎn)在醋酸菌不同屬中的變異規(guī)律，并對(duì)醋酸菌基因組中的前噬菌體序列及插入序列(Insertion sequence，IS)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，揭示噬菌體數(shù)量與CRISPR位點(diǎn)之間的關(guān)系[8]。

1 材料和方法

1.1 材料

Ab3基因組序列的測(cè)序與分析是由浙江工商大學(xué)梁新樂實(shí)驗(yàn)室完成(GenBank編號(hào)：CP012111)，其余27株醋桿菌，9株葡糖醋桿菌以及11株葡糖桿菌的基因組序列GenBank編號(hào)見附表1。上述基因組序列均可從NCBI網(wǎng)站下載(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi)。

1.2 方法

1.2.1 醋酸菌中CRISPR位點(diǎn)查找

完整基因組中CRISPR結(jié)構(gòu)的查找主要根據(jù)CRISPRdb數(shù)據(jù)庫(kù)[10]。Draft基因組序列中CRISPR的查找主要通過CRISPRfinder(http://crispr.u-psud.fr/)以及CRT軟件完成[21]。

1.2.2 CRISPR位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析

同向重復(fù)序列的比對(duì)通過ClustalW完成，Draft 基因組中的基因的查找通過本地BLAST完成。前導(dǎo)序列的多序列比對(duì)分析同過ClustalW 以及BLAST 和WEBLOGO[22]完成。對(duì)獲得的CRISPR位點(diǎn)中的同向重復(fù)序列進(jìn)行歸類分析，共分為8個(gè)(CRISPR 1~8)。通過MEGA 6.0對(duì)不同種類的同向重復(fù)序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化聚類分析[23]。選取CRISPR結(jié)構(gòu)位點(diǎn)中第一個(gè)重復(fù)序列上游1000 bp序列作為前導(dǎo)序列查找的對(duì)象，通過ClustalW反復(fù)比對(duì)分析，找出保守的motif區(qū)?；蛐蛄械木垲惙治龇椒ê屯蛑貜?fù)序列相同。

1.2.3 基因組中噬菌體區(qū)域及IS序列預(yù)測(cè)

醋酸菌基因組中噬菌體區(qū)域的預(yù)測(cè)通過PHAST[24]以及Prophinder[25]共同完成。插入序列由ISfinder(https://www-is.biotoul.fr/)[26]完成(=1e-10)。原核生物啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)由在線軟件(http://www.fruitfly. org/seq_tools/promoter.html) 進(jìn)行(采用默認(rèn)參數(shù))。

1.2.4 CRISPR與噬菌體及IS序列的統(tǒng)計(jì)分析

通過非參數(shù)檢驗(yàn)Wilcoxon rank sum test比較存在CRISPR與不存在CRISPR位點(diǎn)的菌株之間的噬菌體及IS數(shù)量的差異。由Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行CRISPR的間隔序列或重復(fù)序列與噬菌體及IS序列數(shù)量的相關(guān)性分析。所有統(tǒng)計(jì)分析由軟件Origin 8.5完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌CRISPR結(jié)構(gòu)位點(diǎn)的基因組分布概況

48株醋酸菌CRISPR位點(diǎn)分析結(jié)果表明，32株醋酸菌含有至少一個(gè)CRISPR 結(jié)構(gòu)(附表2)，其中醋桿菌屬19株，葡糖醋桿菌屬6株，葡糖桿菌屬7株。根據(jù)CRISPRdb數(shù)據(jù)庫(kù)信息，4株具有完整基因組序列菌株的9個(gè)CRISPR結(jié)構(gòu)位點(diǎn)如圖1所示。醋桿菌屬CRISPR的平均個(gè)數(shù)是1.8個(gè)(Ab3基因組序列中不含有CRISPR結(jié)構(gòu))，低于葡糖醋桿菌屬的2.7個(gè)以及葡糖桿菌屬的3.3個(gè)。醋桿菌屬中，CRISPR數(shù)量最少的是DSM 23921和DMCS_004以及巴氏醋桿菌()，都只有1個(gè)CRISPR，特別是巴氏醋桿菌的CRISPR結(jié)構(gòu)均位于質(zhì)粒上，在其染色體上未發(fā)現(xiàn)CRISPR結(jié)構(gòu)的存在；CRISPR結(jié)構(gòu)數(shù)最多的是4H-1和NBRC 16470 (各4個(gè))。葡糖醋桿菌屬中，CRISPR數(shù)最少的是E25，只有1個(gè)，其他葡糖醋桿菌則含有2~4個(gè)CRISPR結(jié)構(gòu)。葡糖桿菌屬中，CRISPR結(jié)構(gòu)數(shù)量相對(duì)最多，幾乎都含有3~4個(gè)。

圖1 4株醋酸菌中9個(gè)CRISPR位點(diǎn)結(jié)構(gòu)示意圖

Apa：巴氏醋桿菌IFO 3283-01；Gad：PAI 5；Gax：s NBRC 3288；Gox:H24。不同顏色的箭頭代表不同的基因；紅色線條代表重復(fù)序列(Repeats)。

對(duì)32株醋酸菌的CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)醋酸桿菌屬中的CRISPR-Cas系統(tǒng)主要屬于I-E、I-F、I-C等類型(包含和基因)，其中ATCC 23746的基因組序列中存在著II類Cas系統(tǒng)(附表2，附圖1)。葡糖醋桿菌屬中的CRISPR-Cas系統(tǒng)主要屬于I-E和I-D，其中在PAI 5的基因組序列中存在著3種CRISPR-Cas系統(tǒng)：I-E類，I-D類以及II類。而在葡糖桿菌屬的7個(gè)基因組序列中，CRISPR-Cas系統(tǒng)均屬于I-E類。3個(gè)屬所有菌株的基因組序列中皆不含III類CRISPR-Cas系統(tǒng)，不同菌株基因組中的CRISPR-Cas結(jié)構(gòu)情況如附圖1所示。不同醋酸菌屬的菌種基因組序列中具有相同類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。

本研究所用的48個(gè)菌株共含有73個(gè)CRISPR, 其中確定位點(diǎn)有51個(gè)，可疑的有22個(gè)。為了便于分析，根據(jù)重復(fù)序列的相似情況將CRISPR分為9組，分別為8個(gè)類別(CRISPR 1~8)及其他(表1)。其中在CRISPR 1~8中重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的規(guī)律性，而且在各個(gè)類型中重復(fù)序列具有較好的保守性。在其他類型中的重復(fù)序列多是可疑位點(diǎn)，保守性較差，沒有一定的規(guī)律性。CRISPR 1~7在醋桿菌屬、葡糖醋桿菌屬和葡糖桿菌屬中都存在，而CRISPR 8只存在于NBRC 3255和NBRC 3257中。另外，具有相同類型CRISPR-Cas系統(tǒng)的菌株中，CRISPR的數(shù)量和結(jié)構(gòu)卻存在著較大的差異(附表2)。

表1 CRISPR重復(fù)序列的分類分析

注：下劃線代表重復(fù)序列變異型中突變的堿基(和典型重復(fù)序列相比)。

2.2 重復(fù)序列與Cas蛋白的進(jìn)化分析

根據(jù)48株醋酸菌重復(fù)序列的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，相同的重復(fù)序列在不同屬的菌株中廣泛分布且具有一定的保守性(附表2)。而在同種的不同菌株中，重復(fù)序列也存在著差異性，這種差異性體現(xiàn)在部分堿基突變以及CRISPR結(jié)構(gòu)的不同(表1)。以重復(fù)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明醋桿菌屬、葡糖醋桿菌屬和葡糖桿菌屬的菌種互相混雜，不能彼此分開，因此不能利用該序列對(duì)不同屬的菌種進(jìn)行分類(圖2A)。每一個(gè)CRISPR類型中(1~8)都包含了來(lái)自不同屬的菌種，這說(shuō)明菌種在遺傳進(jìn)化過程中可能形成了相同的防御體系。聚類分析同時(shí)也顯示，同一種內(nèi)的CRISPR具有完全不同的重復(fù)序列，如NBRC 3255中的Gth 5和Gth 6(附表2，圖2A)。

圖2 利用醋桿菌屬(A)、葡糖醋桿菌屬(Ga)和葡糖桿菌屬(G)中的重復(fù)序列以及cas1基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖

A：利用重復(fù)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹；B：利用基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹。不同顏色的分支代表來(lái)源于不同種屬的菌株。

重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)在不同的物種間的差異明顯，即使在不同的種或者同一種內(nèi)不同分離株的CRISPR結(jié)構(gòu)中，重復(fù)數(shù)的差異依然存在。醋桿菌屬中34個(gè)CRISPR位點(diǎn)共有443個(gè)重復(fù)序列，長(zhǎng)度在23 bp到38 bp不等(包括確定的和可疑的，確定的CRISPR中重復(fù)序列長(zhǎng)度在30 bp左右)。在這34個(gè)CRISPR中重復(fù)數(shù)最高可達(dá)38個(gè)(ATCC 23746)，最低只有2個(gè)。葡糖醋桿菌屬中的16個(gè)CRISPR位點(diǎn)中共有131個(gè)重復(fù)序列，長(zhǎng)度在23 bp 到36 bp 不等(同樣，確定的CRISPR中重復(fù)序列長(zhǎng)度在30 bp左右)。在這些CRISPR中重復(fù)數(shù)最高可達(dá)30個(gè)(PAI 5)，最低也只有2個(gè)。葡糖桿菌屬中共有23個(gè)CRISPR結(jié)構(gòu)，共有136個(gè)重復(fù)序列, 長(zhǎng)度在23 bp 到30 bp不等，大多數(shù)在30 bp左右，而CRISPR中重復(fù)數(shù)最高只有10個(gè)，遠(yuǎn)低于醋桿菌屬以及葡糖醋桿菌屬中的菌株，最低的重復(fù)數(shù)只有2個(gè)(附表2)。

Cas蛋白的比較基因組分析表明，在絕大多數(shù)的CRISPR結(jié)構(gòu)重復(fù)序列上游或者下游位置存在著和Cas蛋白編碼相關(guān)的基因序列。根據(jù)CRISPRdb數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)分析，巴氏醋桿菌() CRISPR結(jié)構(gòu)Apa 1中重復(fù)序列的上游存在著、7、、、以及基因(圖1)。而葡糖醋桿菌中的Gax 2和葡糖桿菌中的Gox 1 (圖1)不存在基因。同時(shí)，在Gad 3和Gax 3中基因的排列順序高度一致，依次是----7---?；虻倪M(jìn)化聚類分析發(fā)現(xiàn)基因的保守性和重復(fù)序列相關(guān)，重復(fù)序列在不同物種間的保守性也使得基因保守(圖2B)，與前人的研究結(jié)果相吻合[19]。

2.3 間隔序列與前導(dǎo)序列的比較分析

在48株醋酸菌的73個(gè)CRISPR位點(diǎn)中共含有637個(gè)間隔序列，長(zhǎng)度從18~60 bp不等。雖然在同一物種中不同CRISPR中間隔序列長(zhǎng)度不一，但分析結(jié)果表明在CRISPR1~8分類中，CRISPR 1、CRISPR 2、CRISPR 3、CRISPR 4、CRISPR 6 以及CRISPR 7的間隔序列長(zhǎng)度幾乎都在32 bp, CRISPR 5的間隔序列長(zhǎng)度在34 bp, CRISPR 8中的間隔序列長(zhǎng)度在33 bp(表1)。

對(duì)48株醋酸菌的51個(gè)確定的CRISPR結(jié)構(gòu)中的前導(dǎo)序列進(jìn)行比對(duì)分析，比對(duì)時(shí)選取各個(gè)位點(diǎn)第一個(gè)重復(fù)上游1000 bp富含AT區(qū)域作為研究對(duì)象。經(jīng)過ClustalW以及本地BLAST的反復(fù)比對(duì)分析，在7個(gè)菌種的13個(gè)CRISPR位點(diǎn)(Aac 3、Gox 1、Gox 2、Gfr 1、Gfr 2、Gfr 3、Gfr 4、Gth 2、Gth 4、Gth 5、Gth 6、Gth 7、Gth 12)的上游序列中發(fā)現(xiàn)一段較為保守的短motif序列(圖3A)。該序列靠近第一個(gè)重復(fù)序列，以“AAATCGG”堿基序列開始，以“GAAGAG”結(jié)束。保守結(jié)構(gòu)中存在著眾多的連續(xù)的“TTTT”結(jié)構(gòu)，并有較明顯的堿基突變，說(shuō)明這些富含AT的區(qū)域與基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。進(jìn)一步啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析，表明大部分前導(dǎo)序列中含有原核生物的啟動(dòng)子序列及其典型的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(圖3B)。

圖3 CRISPR前導(dǎo)序列的的保守motif區(qū)域與啟動(dòng)子位點(diǎn)比較分析

A：13個(gè)CRISPR前導(dǎo)序列具有保守motif；B：3個(gè)菌株預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的序列比對(duì)，黑框代表可能的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)。

2.4 間隔序列數(shù)量與前噬菌體數(shù)量、IS序列數(shù)量的相關(guān)性分析

對(duì)32株醋酸菌基因組中的前噬菌體序列預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在醋酸菌的基因組序列中皆存在著前噬菌體

(至少1個(gè)，最多6個(gè))。醋桿菌屬15個(gè)基因組序列中的前噬菌體平均數(shù)量為2.49個(gè)，低于葡糖醋桿菌屬(7個(gè)基因組序列)中的3.86個(gè)，高于葡糖桿菌屬(10個(gè)基因組序列)中的1.8個(gè)(附表3)。在研究前噬菌體數(shù)量與CRISPR數(shù)量之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在不存在CRISPR結(jié)構(gòu)的基因組序列中的前噬菌體數(shù)量并未多于其他含有多個(gè)CRISPR結(jié)構(gòu)的基因組序列中的前噬菌體個(gè)數(shù)，32株醋酸菌基因組序列中的前噬菌體個(gè)數(shù)與CRISPR未有顯著的相關(guān)關(guān)系(=0.58)。而醋酸菌基因組序列中的前噬菌體個(gè)數(shù)與間隔序列個(gè)數(shù)在整體上存在著正相關(guān)趨勢(shì)(菌株174Bp2、LMG 18494和LMG 18890不能在其基因組序列中找到CRISPR- Cas系統(tǒng)的相關(guān)編碼基因(附表 2)，為了減少統(tǒng)計(jì)結(jié)果產(chǎn)生的誤差，因此將這3株菌排除在外)(圖4A) (Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)：=0.40，＝0.04)。對(duì)醋酸菌基因組中IS序列的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，葡糖桿菌屬基因組序列中的IS序列個(gè)數(shù)是最多的(平均53.71)，遠(yuǎn)高于醋桿菌屬的22.33個(gè)以及葡糖醋桿菌屬的24.2個(gè)，并與前噬菌體數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系?；蚪M序列中IS序列個(gè)數(shù)在PAI 5中最多(84個(gè))，在21F-2中最少(4個(gè))。同時(shí)分析IS序列與間隔序列個(gè)數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，插入序列和間隔序列間存在著顯著的正相關(guān)趨勢(shì)(圖4B)(Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)：=0.65，＝4.32E-4)，與前噬菌體數(shù)量和間隔序列個(gè)數(shù)之間的關(guān)系時(shí)相一致。另外，葡糖醋桿菌屬中的部分菌株擁有較多的插入序列可能與其基因組整體大小較大相關(guān)。

圖4 噬菌體數(shù)量及IS序列與CRISPR數(shù)量關(guān)系圖

A：噬菌體數(shù)量與間隔序列數(shù)量的關(guān)系；B：IS序列數(shù)量與間隔序列數(shù)量的關(guān)系。

3 討 論

CRISPR結(jié)構(gòu)作為一種新發(fā)現(xiàn)的抵御噬菌體、病毒等外源核酸入侵的細(xì)胞防御機(jī)制，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。微生物在發(fā)酵過程中容易受到噬菌體的污染， CRISPR可以抵抗噬菌體的侵染，這給微生物發(fā)酵工業(yè)解決噬菌體污染帶來(lái)全新的解決辦法。隨著人們對(duì)CRISPR功能的深入理解，CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)正被廣泛應(yīng)用于微生物的基因組改造[17]。而對(duì)醋酸菌CRISPR的研究，將有助于醋酸發(fā)酵菌種的進(jìn)一步改造與控制。傳統(tǒng)醋酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生很高的酸度環(huán)境，用于醋酸發(fā)酵生產(chǎn)的醋酸菌，特別是醋桿菌屬和葡糖醋桿菌屬，通常具有較高耐酸性能，而其基因組如何適應(yīng)高酸度發(fā)酵環(huán)境的進(jìn)化機(jī)制還有待研究。比較基因組研究發(fā)現(xiàn)醋桿菌屬和葡糖醋桿菌屬的基因組序列中存在大量的噬菌體核酸序列[1]，這與醋酸菌種性能的穩(wěn)定性及醋酸發(fā)酵質(zhì)量都有重要的影響。

本文對(duì)醋酸菌3個(gè)主要屬中的48株菌進(jìn)行了CRISPR位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)48株菌中有32株含有CRISPR結(jié)構(gòu)，而CRISPR-Cas系統(tǒng)的分類表明大部分CRISPR-Cas系統(tǒng)屬于I類中的I-E 和I-F亞類型，少數(shù)菌株的基因組序列中存在著II類的Cas系統(tǒng)，而所有菌株中皆未發(fā)現(xiàn)III類Cas系統(tǒng)。從CRISPR的分布情況來(lái)看，葡糖桿菌屬和葡糖醋桿菌屬的CRISPR數(shù)量多于醋桿菌屬，這與醋桿菌基因組序列中含有較多的噬菌體序列和轉(zhuǎn)座子的現(xiàn)象相對(duì)應(yīng)。相同的CRISPR在不同屬的各菌株中均有分布，具有一定的保守性，推測(cè)這3個(gè)菌屬的遺傳性質(zhì)比較接近。而重復(fù)序列進(jìn)化分析表明重復(fù)序列不適合用于不同屬的菌株之間的分類，說(shuō)明CRISPR主要是通過水平轉(zhuǎn)移機(jī)制在菌株間傳遞并獨(dú)立進(jìn)化。不同CRISPR類別(CRISPR 1~8)中的間隔序列長(zhǎng)度幾乎相同，預(yù)示醋酸菌在發(fā)酵過程中受到相同或相似的噬菌體入侵。另外，CRISPR結(jié)構(gòu)在同屬而不同種中的差異性可能揭示了不同菌種對(duì)外源DNA干擾的抵御能力的差異性，而CRISPR結(jié)構(gòu)在同種不同菌株中的差異性也提示外源DNA入侵的多樣性。

通過s基因的研究發(fā)現(xiàn)，基因在不同屬中存在著保守性，而這一現(xiàn)象剛好和重復(fù)序列的保守性相吻合。此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的基因的作用和重復(fù)序列相關(guān)相一致[19]，說(shuō)明它們可能受相似的功能選擇壓力。前導(dǎo)序列在不同物種間并不保守[27]，對(duì)醋酸菌51個(gè)已確定的CRISPR位點(diǎn)的前導(dǎo)序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在7個(gè)種的13個(gè)CRISPR位點(diǎn)序列上游有一段短的相對(duì)保守的motif。該段序列在不同的物種中堿基突變率較大，沒有明顯的回文特征，推測(cè)可能是由于生長(zhǎng)環(huán)境不同，導(dǎo)致醋酸菌基因組部分序列在遺傳進(jìn)化過程中發(fā)生了較大的變化，進(jìn)而形成了菌株之間的差異，這也與Yoshinao等[2]全基因組比較分析結(jié)果相似。

Takashi等[28]研究發(fā)現(xiàn)在中，前噬菌體的數(shù)量與CRISPR的數(shù)量存在著負(fù)相關(guān)關(guān)系，CRISPR限制了噬菌體的侵入。然而，對(duì)醋酸菌基因組序列中前噬菌體區(qū)域數(shù)量與CRISPR以及間隔序列數(shù)量關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，醋酸菌基因組中前噬菌體區(qū)域數(shù)量與間隔序列數(shù)量呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)，即前噬菌體的數(shù)量并不會(huì)因?yàn)殚g隔序列數(shù)量增多而減少。出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象的原因可能是醋酸菌在進(jìn)化過程中，由于生存環(huán)境的變化，噬菌體的侵染概率以及侵染噬菌體種類都會(huì)有差異，因此當(dāng)外界噬菌體以及病毒的侵染數(shù)量和種類增加時(shí)，醋酸菌基因組中的CRISPR位點(diǎn)會(huì)相應(yīng)的增加。另外，這種現(xiàn)象可能也與醋酸菌基因組有較強(qiáng)的不穩(wěn)定性相關(guān)，容易受外源DNA的侵入。因?yàn)樵贗S序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，醋酸菌基因組中IS序列與間隔序列數(shù)量也同樣呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)。

總之，本文首次對(duì)醋酸菌3個(gè)主要屬中的CRISPR結(jié)構(gòu)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，其CRISPR結(jié)構(gòu)的闡明為今后抗噬菌體工程醋酸菌的構(gòu)建以及醋酸菌CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因敲除研究提供了思路。同時(shí)CRISPR位點(diǎn)的研究有助于揭示醋酸菌基因組的不穩(wěn)定性及其對(duì)高酸環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)化的分子遺傳機(jī)制。

附錄:附圖和附表見電子版www.chinagene.cn。

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Comparative genomics and evolutionary analysis of CRISPR loci in acetic acid bacteria

Kai Xia, Xinle Liang, Yudong Li

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) is a widespread adaptive immunity system that exists in most archaea and many bacteria against foreign DNA, such as phages, viruses and plasmids. In general, CRISPR system consists of direct repeat, leader, spacer and CRISPR-associated sequences. Acetic acid bacteria (AAB) play an important role in industrial fermentation of vinegar and bioelectrochemistry. To investigate the polymorphism and evolution pattern of CRISPR loci in acetic acid bacteria, bioinformatic analyses were performed on 48 species from three main genera (,r and) with whole genome sequences available from the NCBI database. The results showed that the CRISPR system existed in 32 species of the 48 strains studied. Most of the CRISPR-Cas system in AAB belonged to type I CRISPR–Cas system (subtype E and C), but type II CRISPR-Cas system which containgene was only found in the genusand. The repeat sequences of some CRISPR were highly conserved among species from different genera, and the leader sequences of some CRISPR possessed conservative motif, which was associated with regulated promoters. Moreover, phylogenetic analysis ofdemonstrated that they were suitable for classification of species. The conservation ofgenes was associated with that of repeat sequences among different strains, suggesting they were subjected to similar functional constraints. Moreover, the number of spacer was positively correlated with the number of prophages and insertion sequences, indicating the acetic acid bacteria were continually invaded by new foreign DNA. The comparative analysis of CRISR loci in acetic acid bacteria provided the basis for investigating the molecular mechanism of different acetic acid tolerance and genome stability in acetic acid bacteria.

acetic acid bacteria; CRISPR; repeat sequence; genetic evolution

2015-06-01;

2015-09-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：3117175)和浙江省自然科學(xué)基金(編號(hào)：LY14C060001)資助

夏凱，碩士研究生，專業(yè)方向：醋酸菌分子生物學(xué)。E-mail: xiakai333@126.com

李余動(dòng)，博士，副教授，研究方向：微生物基因組學(xué)。E-mail: lyd@zjsu.edu.cn

10.16288/j.yczz.15-244

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2015-10-8 15:57:12

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20151008.1557.002.html

(責(zé)任編委: 謝建平)