劉忠偉

（吉林市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科二療區(qū)，吉林 吉林 132001）

TWEAK蛋白在出血后大鼠腦組織中的表達(dá)及在腦水腫中的作用研究

劉忠偉

（吉林市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科二療區(qū)，吉林 吉林 132001）

目的 TWEAK（TNF-like weak inducer of apoptosis）腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑是腫瘤壞死因子家族成員之一，最近研究表明TWEAK在腦缺血后的腦水腫形成中起重要作用，但在腦出血中的作用卻缺乏研究證據(jù)。本研究觀察TWEAK在大鼠腦出血后腦組織中的表達(dá)及抗TWEAK單克隆抗體對(duì)出血后腦水腫形成的影響。方法 免疫印記定量檢測(cè)對(duì)照組及出血后3 h、4.5 h、6 h 及1 d、2 d、7 d大鼠腦組織TWEAK蛋白。顱內(nèi)注射抗TWEAK單克隆抗體觀察TWEAK在大鼠出血后24 h對(duì)腦水腫形成的影響。結(jié)果 免疫印記表明TWEAK在對(duì)照組有基本表達(dá)，從出血后3～6 h表達(dá)明顯增加，在6 h達(dá)到高峰。接著在第1、2和7天開(kāi)始向正常水平回落。此外，與PBS對(duì)照組相比，抗TWEAK單克隆抗體能明顯降低大鼠腦出血后24 h腦水腫的形成[從（81.8±0.5）%到（78.3±0.3）%，P＜0.01]。然而在對(duì)側(cè)基底節(jié)，TWEAK對(duì)腦水含量沒(méi)有影響。結(jié)論 TWEAK在腦出血后的3 h、4.5 h、6 h、24 h表達(dá)上調(diào)，并在6 h達(dá)到高峰，1 d開(kāi)始表達(dá)向正?；芈洹４送?，TWEAK抑制劑在大鼠腦出血后第二天能明顯降低腦水腫的形成。

腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑；免疫印記；腦出血；腦水腫

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器：兔抗鼠anti-TWEAK單克隆抗體和多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，立體定位儀及圖像分析系統(tǒng)由中心實(shí)驗(yàn)室學(xué)提供。

1.2動(dòng)物模型及分組：選用注入自體動(dòng)脈血建立大鼠腦出血模型[1]，大鼠用水合氯醛麻醉（350 mg/kg，i.p.）后放置于立體定位儀上，在左側(cè)顱骨（前囟前0.2 mm，中線左側(cè)3 mm）轉(zhuǎn)約1 mm大小的孔（圖1A、圖2），自體股動(dòng)脈血（至少50 μL）被收集到無(wú)菌不加任何抗凝劑的無(wú)針胰島素注射器內(nèi)。26號(hào)針頭立即連接到注射器，用立體定向儀將50 μL股動(dòng)脈血引入到左側(cè)頭骨轉(zhuǎn)孔表面下5.5 mm下的尾狀核位置。50 μL股動(dòng)脈血共10 min注完，留針15 min以防反流。用骨蠟封顱孔，頭皮縫合后放入籠內(nèi)，自由進(jìn)食水。對(duì)照組僅不注血。動(dòng)物分別在出血損傷后3 h、4.5 h 、6 h、1 d、2 d和7 d被處死用于實(shí)驗(yàn)分析。將動(dòng)物隨機(jī)分成A、B、C三組。A組用于觀察TWEAK在對(duì)照組腦組織及出血腦組織TWEAK蛋白表達(dá)。分對(duì)照組（僅不注血，余同出血組），每組3只；出血模型組，模型組在分成出血后3 h、4.5 h、6 h、24 h、48 h、7 d 6個(gè)亞組，每個(gè)亞組3只。C組用于觀察顱內(nèi)注射anti-TWEAKmAb（10 μg，20 μL）或同體積PBS后腦水含量變化。分PBS組，anti-TWEAKmAb組，每組6只。

1.3TWEAK蛋白的免疫印跡（Western Blot）檢測(cè)：免疫印跡用于TWEAK定量分析并確認(rèn)TWEAK抗體的特異性。將大鼠注入50 μL生理鹽水（對(duì)照組）或50 μL自體動(dòng)脈血。對(duì)照組在出血后24 h將其處死，出血組分別在出血后3 h、4.5 h、6 h、1 d、2 d、10 d將其處死（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只），大鼠經(jīng)水合氯醛過(guò)量麻醉后立即取腦，將其切成3 mm厚的冠狀組織塊（距額極4 mm處開(kāi)始），組織勻漿后加入包含有62.5 mmol/L的This-HCl，2%十二烷基硫酸鈉（SDS），10%甘油以及50 mmol/L脫氧膽酸的3倍于組織體積的裂解液，裂解20 min后離心（4 ℃，14000 g，15 min），取上清后放于-70 ℃冰箱中備用。采用牛血清蛋白（BSA）檢測(cè)蛋白濃度。每個(gè)凝膠泳道加入15 μg蛋白，用15%分離膠分離蛋白，然后在轉(zhuǎn)膜液中將蛋白轉(zhuǎn)到醋酸纖維膜上，將膜放入含5%脫脂奶粉的TBST液（100 mmol/L Tris，pH 7.6，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween 20）中封閉1 h，接著用兔抗鼠TWEAK多克隆抗體（1∶800；Abcam，USA貨號(hào)ab37170）室溫孵育1 h，TBST清洗3次，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG-HRP（1∶6000；Santa Cruz Biotechnology）孵育1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)觀察與IgG-HRP結(jié)合的TWEAK抗體，用圖像分析系統(tǒng)分析TWEAK蛋白免疫印跡條帶的光密度。

圖1　A Western blot，出血后各時(shí)間點(diǎn)TWEAK的蛋白表達(dá)

圖1　B TWEAK蛋白的免疫印記分析。將各時(shí)間點(diǎn)TWEAK的平均蛋白表達(dá)水平與相應(yīng)內(nèi)參表達(dá)的比值比作為標(biāo)準(zhǔn)化比值，得出的各值在相對(duì)0 h值得出比值。*P＜0.05（與0 h值比較）

1.4腦水含量的測(cè)定：將研究動(dòng)物分成兩組，PBS對(duì)照組和抗TWEAK單克隆抗體組，每組6只。50 μL自體動(dòng)脈血注入左側(cè)基底節(jié)后2 h將抗TWEAK單克隆抗體（0.5 mg/mL，Abcam，USA）20 μL注入大鼠第三腦室（前囟，-1；中線，0；背腹，5），對(duì)照組注入同體積的PBS（圖1B、圖2）。24 h后取出腦組織用于測(cè)量腦水腫。先將腦組織從距額極4 mm處切成3 mm厚的冠狀組織塊，在沿中線切開(kāi)成兩個(gè)半球。每個(gè)半球包含有基底節(jié)。這樣，從每個(gè)腦組織中可得2個(gè)樣本，即：同側(cè)及對(duì)側(cè)基底節(jié)。用電子分析天枰稱(chēng)重獲得濕重（WW），而后將組織放入100 ℃恒溫箱中烘烤24 h后獲得干重（DW）。如下公式計(jì)算腦水含量（%）：（WW-DW）/WW×100。

1.5統(tǒng)計(jì)分析：不同組間差異采用t檢驗(yàn)及方差分析進(jìn)行檢測(cè)，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)意義。

2　結(jié)果

2.1免疫印記分析：從Western Blot中可以看出，TWEAK蛋白在對(duì)照組腦組織中有基礎(chǔ)表達(dá)，但從出血后3～6 h表達(dá)明顯增加并在6 h達(dá)到高峰（圖1A-1B）。在第1、2和7天開(kāi)始向正常回落，第7天明顯下降（圖1A-1B），但密度值仍高于對(duì)照組，然而二者沒(méi)有顯著差異。

2.2TWEAK抑制劑對(duì)出血后腦水腫形成的影響：出血后2 h顱內(nèi)注射抗TWEAK單克隆抗體可明顯減少出血后24 h血腫周?chē)乃[形成。在抗TWEAK抗體組，同側(cè)基底節(jié)，腦水含量是（78.3±0.3）%；PBS對(duì)照組，同側(cè)基底節(jié)，腦水含量是（81.8±0.5）%，P＜0.01。在對(duì)側(cè)基底節(jié)抗TWEAK單克隆隆對(duì)腦水含量沒(méi)有影響，與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異（圖2和表1）。

圖2　出血24 h后在Anti-TWEAK組和PBS對(duì)照組中同側(cè)及對(duì)側(cè)基底節(jié)的腦水含量（每組6只）。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。在同側(cè)基底節(jié)，Anti-TWEAK組與PBS組相比能明顯降低腦水腫，二者有顯著差異，P＜0.01，在對(duì)側(cè)基底節(jié)二者沒(méi)有明顯差異，P＞0.05，**P＜0.01（與對(duì)照組比較）

表1　各組腦組織腦水含量變化比較（x-±s，n=6）

3　討論

TWEAK是表達(dá)廣泛的細(xì)胞因子。已有大量研究表明，TWEAK可在多種細(xì)胞和多發(fā)性硬化、缺血性卒中等模型的組織中表達(dá)。但TWEAK是否參與腦出血還不清楚。本研究表明，TWEAK也同樣在腦出血中發(fā)揮作用。首先，本研究表明與對(duì)照組相比TWEAK在出血組表達(dá)上調(diào)。通過(guò)免疫印跡定量檢測(cè)TWEAK蛋白發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比TWEAK在出血后3、4.5、6 h表達(dá)明顯上調(diào)，并在6 h達(dá)到高峰。在出血后的24 h和48 h表達(dá)仍維持在較高水平并開(kāi)始趨于向正常水平緩慢回落，出血后7 d表達(dá)明顯下降，但仍高于對(duì)照組。以上研究表明，TWEAK同樣參與了出血后的腦組織損傷。此外，本研究通過(guò)注射TWEAK抑制劑發(fā)現(xiàn)，與PBS對(duì)照組相比，Anti-TWEAK單克隆抗體能明顯降低大鼠出血同側(cè)基底節(jié)的腦水腫，而對(duì)出血對(duì)側(cè)沒(méi)有影響。這也表明TWEAK可能作為毒性因子在出血后的腦水腫形成中發(fā)揮作用.與缺血性卒中相比，腦出血后可通過(guò)多條途徑造成腦損傷，如炎癥相關(guān)機(jī)制，毒素釋放及蛋白分解酶等[2]。往往比缺血性卒中預(yù)后更差。Potrovita等發(fā)現(xiàn)，在小鼠缺血卒中模型，缺血腦組織中TWEAK表達(dá)能提高2倍[3]。本研究通過(guò)免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，TWEAK表達(dá)在出血后6 h達(dá)到高峰，表達(dá)約提高3倍。這也為腦出血后往往比缺血性卒中有更為嚴(yán)重的損傷和預(yù)后提供了部分線索。此外，本研究免疫印跡還表明TWEAK表達(dá)在出血后6 h達(dá)到高峰后，在24 h和48 h仍維持在較高水平。這表明TWEAK可能在出血后的持續(xù)腦水腫中發(fā)揮作用，TWEAK參與了出血性腦損傷的延遲相。以往研究表明，腦出血后腦水腫要經(jīng)歷兩個(gè)嚴(yán)重階段:出血急性期（＜6 h）和出血后48 h的高峰期[4]。二者可能有不同的作用機(jī)制。本研究表明TWEAK在出血急性期（＜6 h）表達(dá)迅速上調(diào)，提示TWEAK可能在出血急性期發(fā)揮重要作用。因此，在出血急性期治療腦水腫更為有效；TWEAK抑制劑在治療出血后腦水腫方面，特別是在出血急性期，可能更好發(fā)揮治療效用。 綜上所述，應(yīng)用TWEAK抑制劑治療腦水腫可能更為有效，特別是在腦出血急性期（＜6 h）。而且，TWEAK抑制劑也可能會(huì)在出血后的腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。這與傳統(tǒng)滲透性藥物相比可能更具優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用TWEAK抑制劑治療出血后腦水腫很可能成為較為理想的新型療法。

4　結(jié)論

TWEAK蛋白在大鼠腦出血后表達(dá)上調(diào)，并可能參與了出血后腦水腫的形成。TWEAK抑制劑能明顯降低大鼠出血后腦水腫。

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R743.3

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1671-8194（2015）36-0036-02