王端，周鴻翔，王曉丹，邱樹毅，田婭玲

（貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

響應(yīng)面法優(yōu)化酶解核桃多肽提取工藝

王端，周鴻翔*，王曉丹，邱樹毅，田婭玲

（貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

以脫脂粉為原料，利用酶解法提取制備核桃多肽。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，運用Design Expert8.0.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，以多肽得率為響應(yīng)值，研究了底物質(zhì)量濃度、溫度、時間、pH對核桃多肽得率的影響，并優(yōu)化了提取工藝。確定了酶解法提取核桃多肽的最佳工藝條件為：底物質(zhì)量濃度2.3%，溫度51℃，時間5.2 h，pH6.5，在此條件下多肽得率為0.45 g/g。

核桃多肽；酶解法；響應(yīng)面分析法；提取工藝

核桃（Juglans regia L.）又名胡桃，是胡桃科核桃屬植物。其果肉營養(yǎng)豐富，除含有大量的蛋白質(zhì)外，還含有不飽和脂肪酸及維生素、礦物質(zhì)等，被醫(yī)學(xué)家和養(yǎng)生學(xué)家視為益壽精品［1］。近年來科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)經(jīng)人體攝取消化后，并非主要以氨基酸形式吸收，而是以肽的形式吸收［2］。這些肽不僅能提供人體生長、發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，還具有易于吸收，通過消化道進入人體后無任何副作用等優(yōu)點。從生理功能來說，多肽優(yōu)于氨基酸和蛋白質(zhì)，是部分取代氨基酸和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的食品［3-4］，具有調(diào)節(jié)人體機能等多種生理功能，近年來備受各國科學(xué)家和政府的高度重視。因此，本實驗利用中性蛋白酶水解脫脂粉制備多肽，確定最佳水解條件，以期為核桃蛋白的深加工及大規(guī)模生產(chǎn)提供新的思路。

1材料與方法

1.1材料與試劑

核桃：市售一級品；脫脂核桃粕：實驗室自制；谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品：貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司；中性蛋白酶、胰蛋白酶：江蘇銳陽生物科技有限公司，堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶：上海藍季科技發(fā)展有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

50T小型香油液壓壓榨機：德州市恒翔機械制造廠；FW-100高速萬能粉碎機、DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋、101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；723N可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；7DL-40B臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠制造；索氏抽提儀：北京賽福萊科技有限公司；電子天平：FA2004N上海菁海儀器設(shè)備有限公司；ATN-300全自動凱氏定氮儀：上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1核桃肽的制備工藝流程

核桃→去殼→核桃仁→堿液去皮→水洗→低溫烘干核桃仁→粉碎→液壓榨油→核桃粕→粉碎→正己烷去殘油、烘干→脫脂粉→酶解制備多肽→測定多肽得率

1.3.2酶活的測定

蛋白酶酶活的測定：福林法GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》。

1.3.3脫脂粉中基本成分的測定

粗蛋白的測定：凱氏定氮法GB5009.5-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》；粗脂肪的測定：索氏抽提法GB/T 5009.6-2003《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》；水分的測定：直接干燥法GB5009.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》。

1.3.4多肽的測定

采用雙縮脲法［5-6］。

1.3.5響應(yīng)面分析法優(yōu)化核桃蛋白提取工藝

根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，綜合單因素實驗結(jié)果，選取底物質(zhì)量濃度（A）、溫度（B）、酶解時間（C）、pH（D）4個因素為自變量，以多肽得率（R）為目標(biāo)函數(shù)，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進行實驗設(shè)計，其因素水平編碼表如表1所示。

表1　因素水平編碼表Table 1Coding of factors and levels

1.3.6多肽得率的計算

多肽得率/（g/g）=酶解液中多肽的質(zhì)量/脫脂粉的質(zhì)量

2結(jié)果與分析

2.1最適蛋白酶的選擇

經(jīng)正己烷制得的脫脂粉中粗蛋白含量65.38%；粗脂肪含量0.57%；水分含量11.74%。根據(jù)核桃蛋白的氨基酸組成以及酶的性質(zhì)差異，篩選出幾種常見的蛋白酶并在其最適條件下對核桃蛋白進行酶解，酶解效果見圖1。

圖1　蛋白酶種類對核桃蛋白酶解效果的影響Fig.1Effect of protease type on the leaching rate of walnut polypeptide

由圖1可知，中性蛋白酶對核桃多肽的酶解效果最好（得率0.186 g/g），其次是堿性蛋白酶（得率0.151 g/g），胰蛋白酶的效果最差（得率0.116 g/g）。綜合考慮，選擇中性蛋白酶為酶解制備多肽的最佳酶。

2.2響應(yīng)面分析法優(yōu)化核桃多肽的提取工藝

根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，按表1的因素水平編碼表，以多肽得率（R）為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法進行實驗設(shè)計，其實驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。采用Design Expert8.0.6統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行響應(yīng)面回歸分析，回歸方程的方差顯著性檢驗分析結(jié)果如表3所示。

表2　響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2Response surface experimental design and results

續(xù)表2響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Continue table 2Response surface experimental design and results

表3　回歸分析結(jié)果Table 3The results of regression analysis

由表3可知，一次項中，各因素對多肽得率的影響由大到小依次為底物質(zhì)量濃度＞時間＞pH＞溫度，其中底物質(zhì)量濃度和時間的影響極顯著（P＜0.01），pH的影響顯著，而溫度的影響則不顯著；二次項中A、B、C、D對多肽得率的影響都達到極顯著水平（P＜0.01）；交互項中，只有AB對多肽得率有極顯著的影響（P＜0.01），而AC、AD、BC、BD、CD之間的交互作用不顯著。

以A、B、C、D為自變量，多肽得率R（g/g）為響應(yīng)值，建立二次響應(yīng)面回歸模型，經(jīng)Design-Expert8.0.6軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合后，得回歸方程：R=0.41+0.045A+8.833×10-3B+0.015C-0.011D+ 0.036AB-9.750×10-3AC+1.750×10-3AD+2.250×10-3BC+ 0.012BD+9.250×10-3CD-0.075A2-0.049B2-0.027C2-0.048D2

從表3可知，以多肽得率為響應(yīng)值時，模型P＜0.000 1，表明模型的回歸極顯著。同時失擬項P= 0.416 5＞0.05，表明響應(yīng)面試驗結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合良好，試驗誤差小，因此，可以使用該數(shù)學(xué)模型對試驗結(jié)果進行分析。為了考察因素間的交互效應(yīng)關(guān)系對核桃多肽得率的影響，選取兩個因素固定于零水平，繪制響應(yīng)曲面圖，結(jié)果如圖2所示。

圖2　各因素交互效應(yīng)對多肽得率的響應(yīng)曲面圖Fig.2Response surface map of cross effects of each factor

從圖中均可直觀地反映出各因素間的交互效應(yīng)以及對多肽得率的影響?？傮w來看，隨著交互因素編碼值的增大，多肽得率呈現(xiàn)先上升后減小的趨勢。其中，底物質(zhì)量濃度和溫度的交互作用對多肽得率的影響較明顯，呈顯著的先增大后減小趨勢，而其他因素間的兩兩交互作用均是先增大，后增大不明顯，最后減小或先增大后趨于不變。因此，只有當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度、溫度、時間、pH 4個因素間合理組合時才能獲得較好的酶解效果。

2.5試驗條件的優(yōu)化與確定

采用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化的提取工藝條件為底物質(zhì)量濃度2.3%，溫度51℃，時間5.2 h，pH 6.5，多肽得率的預(yù)測值0.42 g/g。在此工藝條件下進行3次重復(fù)驗證試驗，實際測得多肽得率0.45 g/g，比預(yù)測值提高了7.14%，表明響應(yīng)面設(shè)計在核桃多肽提取工藝中可行，結(jié)果可靠。

3結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法對提取核桃多肽進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳工藝條件為：底物質(zhì)量濃度2.3%，溫度51℃，時間5.2 h，pH6.5，在此條件下多肽得率為0.45 g/g。因此，響應(yīng)面分析法為優(yōu)化核桃多肽的提取工藝提供理論依據(jù)。

［1］呂名蕊，史宣明，張驪，等.核桃多肽功能特性及制備工藝研究進展［J］.中國油脂，2013，38（5）:34-38

［2］SZETAO K W C，SATHE S K.Walnut（Juglans Regial）：Proximate Composition，Protein Solubility，Protein Ammo Acid Composition and Protein in Vitro Digestibility［J］.J Sci Food Agric，2000，80: 1393-1401

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Optimization of Extracting Polypeptide from Walnut by Response Surface Methodology

WANG Duan，ZHOU Hong-xiang*，WANG Xiao-dan，QIU Shu-yi，TIAN Ya-ling
（Guizhou Key Lab of Fermenting Engineering and Bio-pharmacy，Wine and Food Engineering College of Guizhou University，Guizhou University，Guiyang 550025，Guizhou，China）

Walnut polypeptide was obstained by enzymatic hydrolysis with the defatted walnut meal as raw material.The preparation process of walnut polypeptide was optimized on foundation of single factor experiment，according to Box-Behnken central composition design principle，the method of response surface analysis with 4 factors and 3 levels combined with Design Expert8.0.6-statistical data analysis software was adopted with the leaching rate of walnut polypeptide as the response value.The effect of substrate concentration，temperature，time and pH on the leaching rate of walnut polypeptide were studied in this paper.According to the above results，the optimum preparation conditions were obtained as follows：substrate concentration 2.3%，temperature 51℃，time 5.2 h，and pH 6.5.Under these conditions，the leaching rate of walnut polypeptide reached 0.45 g/g.

walnut polypeptide；enzymatic hydrolysis；response surface methodology；extraction process

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.006

2015-04-13

貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目（黔科合NZ［2013］3016）

王端（1992—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：食品與生物工程。

周鴻翔（1975—），男，副教授，研究方向：食品加工與生物技術(shù)。