李亞武，張寶善，*，魏冉，王瑋，黃雯

（1.陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710062；2.西北政法大學商學院，陜西西安710122）

醋酸菌分離及其有機酸產(chǎn)生規(guī)律

李亞武1，張寶善1，*，魏冉1，王瑋1，黃雯2

（1.陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710062；2.西北政法大學商學院，陜西西安710122）

研究不同形態(tài)醋酸菌產(chǎn)生有機酸規(guī)律的比較。經(jīng)HPLC法測定有機酸含量發(fā)現(xiàn)：不產(chǎn)膜菌S菌產(chǎn)生奎寧酸、蘋果酸、富馬酸和琥珀酸的能力比產(chǎn)膜菌R菌高；而產(chǎn)生乳酸和檸檬酸的能力低于R菌。因此推斷鳥氨酸循環(huán)、糖異生作用和三羧酸循環(huán)參與醋酸菌菌膜的形成。

醋酸菌；R菌；S菌；產(chǎn)膜

醋酸菌廣泛分布于果園的土壤中、酸敗食物或水果表面［1］，是一大類革蘭氏陰性、嚴格需氧菌，屬于α-變形菌門［2］。早在1868年人們就已經(jīng)確定醋酸菌是傳統(tǒng)釀造醋的主要微生物［3-4］，試驗證明連續(xù)傳代培養(yǎng)后具有高頻率的突變性。有些醋酸菌（產(chǎn)多糖薄膜）發(fā)生變異后，會喪失分泌菌膜的能力；而有些醋酸菌（不分泌菌膜）變異后發(fā)生分泌菌膜的現(xiàn)象。部分研究現(xiàn)象表明，根據(jù)能否分泌菌膜可將醋酸菌分成兩類：一類不產(chǎn)膜且菌落表面光滑，標記為S菌；另一類能具有分泌菌膜的能力而菌落表面粗糙，記為R菌［5］。

醋酸菌多糖薄膜一般懸浮于發(fā)酵液表層，作為提供菌體與氧氣接觸的空間載體［6］。S菌好生長于液態(tài)深層通氣培養(yǎng)液中［7］，不分泌多糖薄膜，只分泌少量的胞外多糖。由于培養(yǎng)液中缺乏多糖薄膜，供氧狀態(tài)低于菌體生長代謝所需水平，故S菌較為適合用于攪拌、振蕩或額外通氧等工藝發(fā)酵高酸度醋品過程。R菌具有分泌多糖薄膜的能力［8］，因此在靜態(tài)培養(yǎng)中，R菌株通過在培養(yǎng)基表面產(chǎn)生薄膜以維持高度的供氧狀態(tài)，其更適合用于表面靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)和淺層振蕩培養(yǎng)。研究表明，菌體多糖薄膜在發(fā)酵工藝中具有存在的必要性，可為菌體細胞篩選出較為適合的外環(huán)境，抵御外環(huán)境內(nèi)的有害物質(zhì)［9］。

通過對醋酸菌分泌多糖薄膜的過程進行研究分析［10-15］，認為檸檬酸循環(huán)、磷酸戊糖循環(huán)和糖異生作用可能參與菌體多糖薄膜生成過程，代謝中間產(chǎn)物多為有機酸，經(jīng)菌體細胞作用釋放到培養(yǎng)液中。選擇以上代謝作用多種中間代謝產(chǎn)物進行測定，研究其變化規(guī)律，推定出參與菌體多糖薄膜分泌的代謝途徑。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗菌種

醋化醋桿菌（Acetobacteraceti，A.aceti）：醋酸菌屬，保藏于陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院食品發(fā)酵試驗室。

1.1.2試驗原料

1.1.2.1濃縮蘋果汁

陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院中試車間出產(chǎn)。

1.1.2.2培養(yǎng)基

土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar medium，PDA）：1 L蒸餾水、200 g土豆、15 g瓊脂、20 g葡萄糖、pH自然。115℃滅菌20 min備用。醋酸菌分離培養(yǎng)基（Yeast Peptone Dextrose Glycerine，YPDG）：1 L蒸餾水、5 g甘油、4%（體積分數(shù)）95%乙醇、5 g胰蛋白胨、5 g葡萄糖、5 g酵母膏、20 g瓊脂，pH自然。115℃滅菌20 min備用。

1.1.3主要試劑與儀器

有機酸標品（乳酸、丙二酸、蘋果酸、檸檬酸、奎寧酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、乙酸和草酸）均購自于Sigma公司；甲醇（色譜純），抗壞血酸、磷酸二氫鉀（分析純）；高效液相色譜（Thermo公司Ultimate 3 000型）。

1.2試驗方法

1.2.1菌種分離與鑒定

分離鑒定試驗流程：

試驗室保藏醋化醋桿菌（A菌）經(jīng)PDA培養(yǎng)基中活化后接種于YPDG培養(yǎng)基，畫線分離出具有白色透明圈的單菌落，進行純化培養(yǎng)，每天觀察并記錄菌落形態(tài)。對不同形態(tài)的單個菌株依照伯杰氏手冊分別進行醋酸菌鑒定［16］（革蘭氏染色鑒定試驗，產(chǎn)酸鑒定試驗，運動性鑒定試驗，醋酸菌生理生化性質(zhì)鑒定試驗）。

1.2.2HPLC法測定有機酸

1.2.2.1色譜條件

DiamonsilC18柱，柱溫25℃，柱子250 mm×4.6 mm，紫外檢測波長210 nm。

1.2.2.2流動相的配置

混合標品Ⅰ（7個有機酸混合標樣）：流動相A，0.01 mol/L磷酸二氫鉀∶甲醇=93∶7（體積分數(shù)），用磷酸調(diào)節(jié)pH為2.2。流動相B，甲醇。流速0.7 mL/min。

混合標品Ⅱ（4個有機酸混合標樣）：流動相A，0.01 mol/L磷酸二氫鉀∶甲醇=93∶7（體積分數(shù)），用磷酸調(diào)節(jié)pH為2.0。流速0.6 mL/min。

注：磷酸鹽溶液對C18柱具有損害作用，因此在使用時需與甲醇混合配置。流動相在使用前均用0.45 μm多孔濾膜真空抽濾處理，以防不溶物阻塞C18柱。標品成分及含量如表1所示。

表1　有機酸混標種類及含量Table 1Organic acid mix type and content

以0.5%接種量（質(zhì)量分數(shù)）接入酵母菌活化液于滅菌蘋果汁中進行酒精發(fā)酵，在30℃下發(fā)酵6 d，直至酒精度達到6%（體積分數(shù)），酒精發(fā)酵結(jié)束。按照10%（體積分數(shù)）接種量接入醋酸菌培養(yǎng)液于發(fā)酵醪液中進行醋酸發(fā)酵，在30℃下R菌恒溫靜態(tài)發(fā)酵15d；S菌以180 r/min轉(zhuǎn)速振蕩發(fā)酵15 d；同時分別在平行條件下選擇A菌作為對照。每隔3天取1 mL發(fā)酵液，稀釋3倍后經(jīng)0.22 μm孔徑有機膜過濾后HPLC法檢測有機酸含量。

2結(jié)果與討論

2.1醋化醋桿菌不同形態(tài)分離鑒定

試驗室保藏醋化醋桿菌經(jīng)PDA培養(yǎng)基中活化后接種于YPDG培養(yǎng)基，畫線分離出具有白色透明圈的單菌落，進行純化培養(yǎng)并每天記錄菌落形態(tài)，觀察單個菌落的形態(tài)穩(wěn)定性。30 d后，傳代培養(yǎng)的醋酸菌菌落形態(tài)趨于穩(wěn)定。其菌落形態(tài)如圖1所示。

圖1　醋酸菌不同菌落形態(tài)Fig.1Different forms of A.acet

圖1（a）中醋酸菌光滑型菌落相互分離，菌體白色，菌落直徑較小，表面光滑，無明顯凸起，呈薄層狀。圖1（b）中醋酸菌粗糙型菌落聚集，相互融合，菌體白色，生長迅速，菌落直徑大，表面粗糙，呈煎蛋型。兩種形態(tài)的菌經(jīng)伯杰氏手冊醋酸菌鑒定方法鑒定均為醋化醋桿菌，根據(jù)其菌落形態(tài)不同，分別標記為S菌（光滑）和R菌（粗糙）。

2.2S菌和R菌有機酸產(chǎn)生規(guī)律的比較

有機酸混合標品Ⅰ的分離結(jié)果見圖2。

圖2　有機酸混合標品Ⅰ分離圖譜Fig.2Organic acids mixedⅠseparation maps

圖2表明，奎寧酸最早被分離出來，其保留時間與水峰較為接近為4.007 min，其余根據(jù)保留時間先后依次是蘋果酸（4.710 min）、丙二酸（5.343 min）、乳酸（5.733 min）、檸檬酸（7.097 min）、富馬酸（8.170 min）、琥珀酸（9.407 min）。

有機酸混合標品Ⅱ的分離結(jié)果見圖3。

由圖3可知，草酸的吸收峰值較高，出峰時間最早，其保留時間為4.237 min，其次依次為酒石酸（4.770 min）、VC（5.250 min）、乙酸（7.423 min）。

圖3　有機酸混合標品Ⅱ分離圖譜Fig.3Organic acids mixedⅡseparation maps

表2　不同有機酸的標準曲線Table 2The standard curve of mixed organic acids

將有機酸混合標品配制成不同的梯度，在相應(yīng)色譜條件下，分別以不同濃度的進樣，求得各成分質(zhì)量濃度y（mg/L）對峰面積x的線性回歸方程；通過線性分析可得各成分的標準曲線，如表2所示，其中，R2值均在0.99以上，證明x與y線性相關(guān)，擬合置信度高。

通過HPLC法測定隨醋酸發(fā)酵時間S菌、R菌和A菌在靜置或振蕩條件下的各種有機酸，所得峰面積經(jīng)加標回收減少誤差后，帶入表2中公式計算可得各有機酸含量，如表3所示。

表3　不同醋酸菌有機酸的產(chǎn)生狀況Table 3Organic acids content in different acetic acid bacteria g/L

續(xù)表3不同醋酸菌有機酸的產(chǎn)生狀況Continue table 3Organic acids content in different acetic acid bacteria g/L

通過分析數(shù)據(jù)可知，在測定的11種有機酸中，除草酸與丙二酸未檢出，其余九種有機酸均有檢出，變化趨勢各有特點。酒石酸的含量在不同條件下均呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，且振蕩培養(yǎng)酒石酸含量高于靜態(tài)培養(yǎng)，認為是由于在發(fā)酵過程中尤其是靜置時酒石酸容易與金屬離子發(fā)生螯合反應(yīng)形成沉淀；VC在發(fā)酵過程中變化微弱，易被氧化因此含量較低；乙酸是醋酸菌代謝主要產(chǎn)物，隨發(fā)酵進行含量逐漸升高，但振蕩培養(yǎng)下乙酸的含量較靜態(tài)培養(yǎng)下的含量略低，與S菌和部分A菌在振蕩培養(yǎng)下具有乙酸過氧化的作用有關(guān)；奎寧酸的含量組內(nèi)較為穩(wěn)定，但S菌發(fā)酵組含量明顯高于其它組，由于其代謝機制尚不明了，根據(jù)其合成機制推測奎寧酸經(jīng)代謝可進入鳥氨酸循環(huán)，導(dǎo)致R菌組和A菌組奎寧酸的含量降低，表明鳥氨酸循環(huán)參與多糖薄膜的產(chǎn)生；蘋果酸的含量隨發(fā)酵時間增大逐漸降低，最終積累量R菌組低于A菌組及S菌組，認為是TCA循環(huán)參與醋酸菌產(chǎn)生薄膜過程，蘋果酸被大量轉(zhuǎn)化為草酰乙酸；乳酸含量逐漸降低，醋酸菌可通過糖異生作用將乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸，同時S菌和部分A菌在振蕩培養(yǎng)下具有過氧化的作用，可將乳酸通過TCA循環(huán)代謝為二氧化碳和水，導(dǎo)致在振蕩組乳酸的含量低于靜置組；隨著發(fā)酵時間的增長，檸檬酸含量增多，靜置組高于振蕩組，分析認為在靜態(tài)培養(yǎng)條件下，TCA循環(huán)參與醋酸菌分泌多糖薄膜作用；富馬酸隨發(fā)酵時間增加其含量逐漸降低，R菌組明顯低于其他組，由于在TCA循環(huán)中，富馬酸被轉(zhuǎn)化為蘋果酸，琥珀酸變化規(guī)律與富馬酸相仿，可顯示出TCA循環(huán)參與菌體分泌多糖薄膜。

3試驗結(jié)論

3.1有機酸變化規(guī)律

1）草酸和丙二酸并未檢測出；

2）VC在發(fā)酵過程中不隨著發(fā)酵時間的變化而變化且含量較低；

3）在發(fā)酵過程中，奎寧酸的含量較為穩(wěn)定，S菌發(fā)酵組積累量具有明顯優(yōu)勢；

4）酒石酸、蘋果酸、富馬酸和琥珀酸含量隨發(fā)酵進行逐漸降低，振蕩組明顯優(yōu)于靜置組；

5）隨發(fā)酵時間增長，乳酸含量降低，靜置組高于振蕩組；

6）乙酸和檸檬酸含量隨發(fā)酵時間增大而增高，靜置培養(yǎng)下積累量高于振蕩條件。

3.2產(chǎn)膜過程代謝機制的探究

通過對不同產(chǎn)膜能力菌株發(fā)酵過程中多種代謝機制中間產(chǎn)物的含量測定，對比組間有機酸變化規(guī)律，認為在醋酸菌分泌多糖薄膜的過程，TCA循環(huán)、糖異生作用和鳥氨酸循環(huán)等細胞代謝機制均以不同形式參與其中。由于部分有機酸代謝機制不明確，因此只能從其含量變化規(guī)律進行推定，但菌體分泌多糖薄膜過程受多種因素交互影響，但具體機制有待進一步研究。

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Separation of Acetobacter aceti and Compared the Rules of Produced Organic Acid

LI Ya-wu1，ZHANG Bao-shan1，*，WEI Ran1，WANG Wei1，HUANG Wen2
（1.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，Shaanxi，China；2.Business School，NorthWest University of Politics&Law，Xi'an 710122，Shaanxi，China）

For compared the rules of different forms of Acetobacter aceti produced organic acid.Determination of organic acids by HPLC method found：S strain had more ability than R strain for produced quinic acid，malic acid，fumaric acid and succinic acid and less ability for produced ability lactic acid and citric acid.Therefore，we can infer that ornithine cycle，gluconeogenesis，and the citric acid cycle involved in the formation of Acetobacter aceti pellice.

Acetobacter；R strain；S strain；pellicle-forming

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.007

2014-03-26

西安市科技計劃項目（SF1234-2）

李亞武（1989—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。