馮唐鍇，江雪，韓文華

（景德鎮(zhèn)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，江西景德鎮(zhèn)333000）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

馮唐鍇，江雪，韓文華

（景德鎮(zhèn)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，江西景德鎮(zhèn)333000）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種新興的核酸擴(kuò)增技術(shù)，被廣泛用于生物特異性核酸片段的檢測(cè)。該技術(shù)在食品檢測(cè)中扮演著越來越重要的角色。簡(jiǎn)介環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的基本原理，并對(duì)該技術(shù)在食品病原體檢測(cè)和轉(zhuǎn)基因食物檢測(cè)等方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；核酸；食品；檢測(cè)

核酸擴(kuò)增是生命科學(xué)領(lǐng)域最重要的技術(shù)手段之一，截止到2015年，使用最廣泛的核酸擴(kuò)增技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），此外還有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，簡(jiǎn)稱LAMP）［1］等技術(shù)。LAMP技術(shù)使DNA擴(kuò)增時(shí)間縮短到1 h以內(nèi)，且靈敏度高、專一性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，十分適合用于食品或食源生物中特定核酸序列的檢測(cè)。

1LAMP技術(shù)簡(jiǎn)介

1.1LAMP特異性引物的設(shè)計(jì)

靶序列選擇和引物設(shè)計(jì)是LAMP技術(shù)成敗的關(guān)鍵。靶序列通常為被檢生物的特異性核酸片段，長(zhǎng)度一般在300 bp以內(nèi)，最好為130 bp～200 bp。選定靶序列后，即可如圖1所示開始設(shè)計(jì)引物。首先在靶序列（+）鏈選取6個(gè)特異區(qū)域（F3c、F2c、F1c，B1、B2、B3），其中F2c和B2為待擴(kuò)增片段兩端長(zhǎng)度為18 nt～24 nt的特異序列，F(xiàn)1c和B1為位于F2c和B2內(nèi)側(cè)的特異序列，且與F2c和B2相距約40 nt，長(zhǎng)度18 nt～24 nt。F3c和B3為分別位于F2c和B2外側(cè)長(zhǎng)度為17nt～21nt的特異序列。（-）鏈中有六段與（+）鏈選定序列互補(bǔ)的區(qū)域（F3、F2、F1、B1c、B2c、B3c）。然后根據(jù)這些特異序列設(shè)計(jì)LAMP引物組，其中包括2條較長(zhǎng)的內(nèi)引物和2條較短的外引物。圖1中F3和B3即為外引物，內(nèi)引物分別被稱為FIP和BIP，F(xiàn)IP包含F(xiàn)1c和F2，其序列特征為5′-F1c-TTTT-F2-3′；BIP包含B1c和B2，序列特征為5′-B1c-TTTT-B2-3′，其中4個(gè)連續(xù)的T是多聚胸腺嘧啶核苷酸連接子［1］。LAMP引物設(shè)計(jì)相當(dāng)復(fù)雜，通常在確定靶序列之后可借助PrimerExplorerV4軟件或LAMP引物設(shè)計(jì)在線網(wǎng)站（http：//primerexplor－er.jp/e/）輔助設(shè)計(jì)［2］。

圖1　靶序列上6對(duì)特異區(qū)域及其相關(guān)引物設(shè)計(jì)Fig.1The 6 specific areas in the target sequence and related primers Design

1.2LAMP反應(yīng)過程

LAMP是特殊的DNA聚合酶（通常為BstDNA聚合酶）在體外擴(kuò)增特定DNA片段的一種方法，反應(yīng)通常分為3個(gè)階段。第一階段為原料底物準(zhǔn)備階段（即啞鈴狀模板合成階段）；第二階段為循環(huán)擴(kuò)增階段；第三階段為伸長(zhǎng)和再循環(huán)階段。第一階段的反應(yīng)需要外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP，該階段形成了一條兩端環(huán)狀的單鏈，又稱“啞鈴結(jié)構(gòu)”。擴(kuò)增階段啞鈴結(jié)構(gòu)的DNA通過自我引導(dǎo)完成延伸，生成雙鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)。最后的伸長(zhǎng)和再循環(huán)階段可在之前的基礎(chǔ)上擴(kuò)增出一系列多環(huán)花椰菜樣復(fù)雜結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物［1］。

1.3LAMP反應(yīng)體系

LAMP反應(yīng)體系包括靶序列模板DNA、引物、DNA聚合酶、緩沖液和dNTP等。反應(yīng)總體積一般為25 μL，其中模板DNA總量控制在10-23mol以內(nèi)；內(nèi)引物FIP和BIP各0.8 μmol/L，外引物F3和B3各0.1 μmol/L～0.2 μmol/L，外引物的濃度一般是內(nèi)引物的1/4～1/10；DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶或BcaBEST DNA聚合酶，體系中總量控制在133.4 nkat～166.7 nkat［1］。LAMP緩沖液中通常還需要加入破壞DNA雙螺旋穩(wěn)定性的物質(zhì)以提高反應(yīng)速率和特異性。

2LAMP技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

LAMP技術(shù)作為一種檢測(cè)手段，在實(shí)踐應(yīng)用當(dāng)中充分顯示了靈敏度高、特異性強(qiáng)、速度快、設(shè)備簡(jiǎn)單以及產(chǎn)物檢測(cè)方便等優(yōu)勢(shì)。截至2015年，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于各種DNA和RNA樣品的檢測(cè)，下面主要介紹該技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域的最新研究及應(yīng)用。

2.1LAMP技術(shù)對(duì)食源致病菌的檢測(cè)

LAMP技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌的研究不斷增多，技術(shù)方法也相對(duì)成熟。以下是利用LAMP技術(shù)檢測(cè)幾種代表性菌種的方法。

利用LAMP技術(shù)檢測(cè)大腸桿菌的研究最為廣泛和成熟。針對(duì)不同類型的大腸桿菌，可選取不同靶序列設(shè)計(jì)引物，開展專門檢測(cè)。羅海等［3］選用不耐熱型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的不耐熱腸毒素（LT）基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了LAMP技術(shù)快速檢測(cè)的方法。劉道亮等［4］針對(duì)肉類中的大腸桿菌O157∶H7，利用其特異性抗原rfbE基因及鞭毛H7特異性抗原fliC基因作為靶序列，設(shè)計(jì)了2套增加了環(huán)引物的改良LAMP引物序列建立快速檢測(cè)方法，肉眼即可觀察結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了單管同時(shí)檢測(cè)。

多種類別的沙門氏菌可導(dǎo)致人畜局部感染性化膿，引起敗血癥，甚至誘發(fā)死亡。萬進(jìn)等［5］以沙門氏菌高度保守的fimY基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)引物，建立LAMP反應(yīng)體系。陽性菌株檢出率100%，該技術(shù)對(duì)牛奶中沙門氏菌污染的快速檢測(cè)相當(dāng)靈敏。張宏偉等［6］則利用該菌種的invA基因設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建的LAMP體系同樣能對(duì)食品中沙門氏菌進(jìn)行很好的檢測(cè)。

葡萄球菌是一種革蘭氏陽性球菌，少數(shù)可致病且為最常見的化膿性球菌。最常見的是金黃色葡萄球菌，該菌種的LAMP檢測(cè)方法較多，蔡克周等［7］利用LAMP方法檢測(cè)了豬血中的金黃色葡萄球菌。劉偉等［8］同樣建立了其他食品金黃色葡萄球菌LAMP檢測(cè)的成熟方法。凝固酶陽性葡萄球菌可引起人的局部化膿感染，也可引起肺炎、敗血癥等多種疾病。張宏偉等［9］利用此菌種特有的coa基因設(shè)計(jì)引物，建立了特異性好、檢出率高的LAMP檢測(cè)方法。

副溶血性弧菌是一種寄生于各種水產(chǎn)品的有害菌，是引起人類食物中毒的重要病原體之一。張毅等［10］將LAMP技術(shù)與疊氮溴化乙錠染色觀察相結(jié)合，以副溶血性弧菌tlh基因作為靶序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了快速檢測(cè)食品中副溶血性弧菌的方法。他們還利用該法實(shí)現(xiàn)了克氏螯蝦寄生副溶血性弧菌的檢測(cè)，其結(jié)果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法一致［11］。

阪崎腸桿菌能引起新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎等，且感染死亡率高。張宏偉等［12］利用阪崎腸桿菌16S-23S rDNA間區(qū)（ITS）序列設(shè)計(jì)特異性引物建立LAMP檢測(cè)方法，該法對(duì)奶粉樣品阪崎腸桿菌檢測(cè)低限達(dá)1.2 CFU/100 g。柏建山等［13］也用類似方法對(duì)寵物乳粉阪崎腸桿菌進(jìn)行了檢測(cè)，同樣取得了較好結(jié)果。

除了上述菌種以外，LAMP技術(shù)還可用于志賀氏菌［14］、單增李斯特氏菌［15］、銅綠假單胞菌［16］、耐熱芽孢菌［17］、溶藻弧菌［18］、霍亂弧菌［19］等多種細(xì)菌的檢測(cè)。

2.2LAMP技術(shù)對(duì)食源致病病毒的檢測(cè)

食源病毒主要存在于家禽、家畜、水產(chǎn)、蔬菜活體中，易導(dǎo)致其大量死亡，造成經(jīng)濟(jì)損失。自Pham等［20］將逆轉(zhuǎn)錄方法和LAMP技術(shù)聯(lián)用形成RT-LAMP技術(shù)，并用于雞新城疫病毒快速診斷之后，該技術(shù)便被廣泛應(yīng)用于各類農(nóng)產(chǎn)品活體中各類病毒的檢測(cè)。

2.2.1家禽病毒檢測(cè)

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）能引起的禽類流感，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。該病毒是RNA病毒，可分為16個(gè)HA亞型，有些亞型可以感染到人，甚至造成死亡。RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)禽流感病毒的靈敏性也很高，適用于農(nóng)場(chǎng)大規(guī)模家禽檢測(cè)［21］。成思佳等［22］針對(duì)H1N1亞型禽流感病毒的M基因和HA基因設(shè)計(jì)了兩組特異性引物，建立了RT-LAMP單管快速檢測(cè)方法，反應(yīng)結(jié)果通過濁度或SYBR Green N熒光進(jìn)行判定，最低可檢測(cè)到10拷貝/管病毒顆粒。彭宜等［23］分別針對(duì)禽流感病毒H1亞型的HA基因及N1、N2亞型的NA基因設(shè)計(jì)了3套LAMP特異性引物，實(shí)現(xiàn)了上述3種亞型病毒的可視化檢測(cè)。李啟明等［24］也建立了敏度達(dá)10拷貝RNA分子水平的H5N1亞型的RT-LAMP檢測(cè)方法。彭宜等［25］和但曉雅等［26］各自利用H9亞型HA基因設(shè)計(jì)引物，建立和改良了適用于H9亞型的RT-LAMP快速檢測(cè)方法。

除禽流感外，RT-LAMP技術(shù)同樣可用于其他禽類病毒的檢測(cè)。鵝副黏病毒會(huì)引起鵝消化道急、烈性傳染病。鮮思美等［27］針對(duì)該病毒F基因設(shè)計(jì)引物，建立了RT-LAMP檢測(cè)方法。鵝細(xì)小病毒又稱小鵝瘟病毒，是嚴(yán)重危害鵝鴨養(yǎng)殖的傳染病源。傅秋玲等［28］針對(duì)該病毒VP3基因設(shè)計(jì)引物，建立了RT-LAMP檢測(cè)方法。禽呼腸孤病毒主要引發(fā)多種禽類的心包炎、肝炎等各種疾病。馬利等［29］針對(duì)該病毒p10基因設(shè)計(jì)引物，建立了使用SYBR GreenⅠ鈣黃綠素?zé)晒怙@示結(jié)果的LAMP檢測(cè)方法。

2.2.2其他動(dòng)物類病毒的檢測(cè)

陳長(zhǎng)木等［30］運(yùn)用RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒，其結(jié)果和傳統(tǒng)RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果的符合率為96.2%。秦智鋒等［31］建立了1套針對(duì)口蹄疫病毒的LAMP檢測(cè)方法，該法可特異性檢出多個(gè)類型的口蹄疫病毒，與其它病毒無交叉反應(yīng)，其靈敏度與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR相當(dāng)，肉眼可直接觀察結(jié)果。楊慧等［32］采用LAMP技術(shù)檢測(cè)犬細(xì)小病毒具有良好的特異性，最低檢出量達(dá)9.3×10-5ng/μL。在水產(chǎn)品檢疫中，Gunimaladevi等［33］首先用RT-LAMP方法檢測(cè)虹了鱒魚及鮭魚中的傳染性造血器官壞死病毒，靈敏度比套式PCR方法高10倍。此外，LAMP還可用于對(duì)蝦黃頭病病毒［34］、對(duì)蝦白斑綜合癥病毒［35］、魚類虹色病毒［36］等許多水產(chǎn)品活體病毒的檢測(cè)。

2.2.3菜蔬等植物病毒的檢測(cè)

除禽、畜病毒外，LAMP技術(shù)同樣能用于蔬菜病毒檢測(cè)。番茄黃化曲葉病毒能引番茄、煙草、南瓜、木薯、棉花等重要經(jīng)濟(jì)作物生長(zhǎng)緩慢，植株嚴(yán)重矮縮，無法正常開花結(jié)果，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成毀滅性危害。Fukuta等［37］針對(duì)該病毒高度保守序列設(shè)計(jì)了LAMP引物，建立了高效便捷的檢測(cè)方法，靈敏度達(dá)傳統(tǒng)PCR法的100倍。

2.3LAMP技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的鑒定

當(dāng)前社會(huì)對(duì)是否推廣轉(zhuǎn)基因食品存在較大爭(zhēng)議，建立靈敏易行的轉(zhuǎn)基因食品鑒定方法顯得尤為必要。LAMP技術(shù)在這方面也能發(fā)揮重大作用，相關(guān)研究已取得了較大進(jìn)展。LAMP技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品的靶基因可以是被轉(zhuǎn)化的基因本身，也可以是轉(zhuǎn)基因常用的啟動(dòng)子。大多數(shù)轉(zhuǎn)基因食品都含有CaMV-35S啟動(dòng)子，因此檢測(cè)該啟動(dòng)子的存在與否可判斷食品是否為轉(zhuǎn)基因。Fukuta等［38］就利用這一原理設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)基因食品的LAMP鑒定方法，肖維威等［39］將該法進(jìn)一步推廣到大豆、玉米、油菜、甜菜等多種轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)上。閆興華等［40］利用外源cordapA基因設(shè)計(jì)LAMP特異引物，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米LY038進(jìn)行了檢測(cè)。于妍等［41］針對(duì)人工改造的外源cry1Ac基因設(shè)計(jì)LAMP特異引物，并利用熒光顯色對(duì)轉(zhuǎn)入該基因的水稻“華恢1號(hào)”進(jìn)行了鑒定。蔡穎等［42］根據(jù)外源插入片段與植物基因組序列設(shè)計(jì)和篩選了品系特異性引物，建立了轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127品系的LAMP快速檢測(cè)方法。

2.4LAMP技術(shù)的其他應(yīng)用

劉昊等［43］利用開心果過敏原Pisv1基因設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了食物過敏原成分的LAMP檢測(cè)方法。Karanis P等［44］則首次將LAMP技術(shù)應(yīng)用到對(duì)隱孢子蟲檢測(cè)上，開辟了食品中寄生蟲檢測(cè)的新途徑。

3小結(jié)

LAMP技術(shù)理論設(shè)計(jì)巧妙，實(shí)踐操作上具有特異性好、靈敏度高、快速便捷、易于觀察及容易推廣等特點(diǎn)，這使得該技術(shù)在食品檢測(cè)方面的應(yīng)用越來越廣泛。靶序列的選擇及引物的設(shè)計(jì)是LAMP成敗的關(guān)鍵，實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化是LAMP方法建立的必要過程。LAMP技術(shù)檢測(cè)結(jié)果可用傳統(tǒng)電泳方法觀察，反應(yīng)后的渾濁度和沉淀量也可直接用肉眼觀察，引入各種熒光染料則能進(jìn)一步提高觀測(cè)效果。針對(duì)RNA對(duì)象的檢測(cè)，則必須進(jìn)一步建立完善的RT-LAMP方法。該技術(shù)也存在其缺點(diǎn)，如不能完整擴(kuò)增較大基因片段，只能作為一種簡(jiǎn)單檢測(cè)手段使用。希望能夠通過技術(shù)創(chuàng)新，將該技術(shù)進(jìn)一步推廣到更加廣闊的基因操作領(lǐng)域。

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The Application of Loop-mediated Isothermal Amplification Technology in Food Detection

FENG Tang-kai，JIANG Xue，HAN Wen-hua
（The Department of Biology and Chemistry，Jingdezhen University，Jingdezhen 333000，Jiangxi，China）

Loop mediated isothermal amplification technology is a kind of new technology in nucleic acid amplification.It is widely used in biological specific nucleic acid detection.This technology has been playing an increasingly important role in food detection.Introduces the basic principle of loop mediated isothermal amplification technology，and reviews the application of the technology in the detection of food borne pathogens and genetically modified food detection.

loop mediated isothermal amplification；nucleic acid；food；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.044

2014-03-24

馮唐鍇（1979—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品生物化學(xué)與分子生物學(xué)。