尚延麗，馮霞，靳野，張曉霞，張柳，馬軍武

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730046)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒引發(fā)的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，其嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的發(fā)展和國(guó)家的經(jīng)濟(jì)貿(mào)易。在我國(guó)，口蹄疫的防制主要依賴于以強(qiáng)制免疫為主的綜合免疫措施，但目前使用的滅活疫苗［1］存在著許多缺點(diǎn)，研究、開發(fā)安全、高效的新型疫苗［2-3］是大勢(shì)所趨，而表位肽疫苗正是其研究熱點(diǎn)之一。表位肽疫苗是指同時(shí)含有多個(gè)目標(biāo)抗原表位和相應(yīng)的輔助性表位的一種新型疫苗?？乖砦皇侵缚乖肿颖砻嫔嫌刑厥饨Y(jié)構(gòu)與免疫活性的化學(xué)基團(tuán)，它代表抗原分子的一個(gè)免疫活性區(qū)，是能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞并且能夠被其識(shí)別的部位。免疫細(xì)胞不是對(duì)完整的抗原分子進(jìn)行識(shí)別，而是僅識(shí)別抗原肽上的表位?？乖砦话凑张c不同的抗原受體細(xì)胞結(jié)合，可分為B細(xì)胞抗原表位與 T細(xì)胞抗原表位，而T細(xì)胞表位可分為CTL表位和輔助性Th表位。

傳統(tǒng)的表位篩選方法(如合成肽庫法、步移重疊多肽法、酸洗脫法等)工作量大、試驗(yàn)成本高、試驗(yàn)周期長(zhǎng)，也可能遺漏一些細(xì)胞表位。目前，細(xì)胞表位篩選方法主要是采用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)法鑒定相結(jié)合來篩選細(xì)胞表位。計(jì)算機(jī)表位預(yù)測(cè)是在已知抗原蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上或者已知氨基酸序列的基礎(chǔ)上根據(jù)氨基酸的理化數(shù)據(jù)特質(zhì)或者肽片段與MHC分子結(jié)合、TAP轉(zhuǎn)運(yùn)過程、蛋白酶體裂解等抗原遞呈過程的規(guī)律，將它們編入計(jì)算機(jī)的算法中，然后用計(jì)算機(jī)軟件來預(yù)測(cè)可能含有表位的區(qū)域。筆者通過多種計(jì)算機(jī)表位預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株結(jié)構(gòu)蛋白VP1上可能的CTL T細(xì)胞表位，綜合分析各軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，篩選出最有可能T細(xì)胞表位的候選表位，旨在為鑒定口蹄疫病毒CTL細(xì)胞表位、研發(fā)表位肽疫苗提供數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 FMDV A/GDMM/CHA/2013株結(jié)構(gòu)蛋白 VP1的核苷酸和氨基酸序列 從GenBank中查詢到FMDV A/GDMM/2013株結(jié)構(gòu)蛋白VP1的序列，并與國(guó)內(nèi)外口蹄疫參考毒株進(jìn)行比較分析。

1.2 CTL T細(xì)胞表位預(yù)測(cè) 應(yīng)用Syfpeithi、IEDB、NetMHC-3.2、IMTECH和BIMAS等多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)FMDV A/GDMM/2013株結(jié)構(gòu)蛋白VP1上的T細(xì)胞表位(表1)。將FMDV A/GDMM/2013 VP1的氨基酸序列輸入各個(gè)網(wǎng)站，分別預(yù)測(cè)了其H-2Dd、H-2Kd、H-2Ld限制性T細(xì)胞表位。候選表位氨基酸長(zhǎng)度參數(shù)為9 mer。選取在各預(yù)測(cè)軟件上分值在前10位，并且在其他軟件前10位重復(fù)率高的肽段做為候選表位。

表1 試驗(yàn)所用的CTL表位預(yù)測(cè)軟件

1.3 候選表位穩(wěn)定性預(yù)測(cè) 使用在線分析軟件ProtParam，分析候選表位的理化性質(zhì)及其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP1基因序列分析 FMDV A/GDMM/2013株結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因(KF450794.1)全長(zhǎng)636個(gè)核苷酸，編碼212個(gè)氨基酸(圖1～2)。通過GenBank同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV A/GDMM/CHA/2013株結(jié)構(gòu)蛋白 VP1基因與A/HuBWH/CHA/2009 VP1 protein(VP1)gene(JF792355.1)同源性為91%，與 A/VIT/11/2004 VP1(1D)gene(HQ116363.1)、A/TAI/7/2003 VP1(1D)gene(HQ116312.1)、/MAY/3/2003 VP1(1D)gene(HQ116297.1)同源性為94%。

2.2 VP1蛋白CTL細(xì)胞表位預(yù)測(cè) 將FMDV A/GDMM//CHA/2013結(jié)構(gòu)蛋白VP1蛋白序列輸入到預(yù)測(cè)軟件，選好MHC的類型及候選表位的長(zhǎng)度。每個(gè)軟件均選取排名的前10位，然后在每個(gè)軟件、每種MHC類型的前10中交叉比較選擇排名靠前且重復(fù)率高的10個(gè)肽段為候選CTL表位(表2～3)。

表2 預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)的VP1蛋白的CTL表位氨基酸序列

表3 篩選出的候選表位在各個(gè)軟件中的排名

2.3 候選表位穩(wěn)定性預(yù)測(cè) 采用在線分析軟件ProtParam，分析篩選出的10條候選表位。由表4可知，pK1、pK4、pD2、pD4和pD5的不穩(wěn)定指數(shù)分別為44.00、68.57、42.26、51.69和43.31。這5個(gè)表位不穩(wěn)定指數(shù)較高，穩(wěn)定性差，可能不是CTL表位。

表4 ProtParam分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

CTL細(xì)胞表面的TCR能夠識(shí)別細(xì)胞表面展示出的MHC-I-抗原肽(CTL細(xì)胞表位)復(fù)合物，并與之結(jié)合，然后殺傷靶細(xì)胞。CTL在抗腫瘤和抗病毒感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)內(nèi)源性抗原通過MHCⅠ類分子展示于細(xì)胞表面后，被CD8T細(xì)胞受體識(shí)別，在共刺激因子作用下CD8T被活化、增殖產(chǎn)生細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)。CTL具有強(qiáng)大的殺傷靶細(xì)胞的能力。CTL通過殺傷介質(zhì)(Perforin、Granayme、Fasl、TRAIL、TNF、IFN-γ 等)來殺傷靶細(xì)胞。CTL 在發(fā)揮效應(yīng)時(shí)(識(shí)別靶細(xì)胞和攻擊靶細(xì)胞)受MHCⅠ類分子的限制，即CTL只殺傷自身MHC遞呈抗原的靶細(xì)胞。由于抗體只能直接結(jié)合體液中的抗原，不能通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)殺傷病原，因此細(xì)胞免疫對(duì)清除病毒和胞內(nèi)寄生菌十分重要，CTL通過殺傷靶細(xì)胞破壞胞內(nèi)病原賴以生存的環(huán)境，在抗體和吞噬細(xì)胞的配合下將病原徹底清除。MHC-Ⅰ類分子僅識(shí)別和結(jié)合內(nèi)源性抗原表位，而CTL發(fā)揮效應(yīng)時(shí)受MHC-Ⅰ的限制，因此僅由MHC-Ⅰ類分子轉(zhuǎn)運(yùn)的抗原表位才能夠誘發(fā)CTL效應(yīng)，這類抗原表位就是CTL表位。

研究表明，自然宿主抗口蹄疫病毒感染的能力與高水平的中和抗體水平有重要相關(guān)性。此外，中和抗體的產(chǎn)生離不開Th細(xì)胞的輔助作用，因此以前對(duì)口蹄疫病毒抗原表位的研究主要是針對(duì)B細(xì)胞表位和Th細(xì)胞表位。但是，有研究表明細(xì)胞免疫在FMDV免疫應(yīng)答中也扮演著非常重要的角色［4-7］。因此，研究口蹄疫病毒的CTL表位具有重要意義，進(jìn)一步充實(shí)了口蹄疫病毒表位數(shù)據(jù)庫資料，也為深入了解細(xì)胞介導(dǎo)的抗口蹄疫病毒免疫鋪墊了基礎(chǔ)。

該研究的口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株是2013年從我國(guó)廣東省茂名市分離的豬源毒，由國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室保存。該毒株屬于A型ASIA拓?fù)湫?東南亞)-97毒株，其基因與A/HuBWH/CHA/2009(JF792355)同源性小于91.5%，其基因與我國(guó)歷史毒株AF/72的同源性小于81.6%，而其基因與2004年越南毒株A/VIT/11/2004大于93.7%。這表明它同我國(guó)歷史毒株AF/72無直接遺傳衍化關(guān)系，考慮到時(shí)間因素，其與2009年流行毒株A/HuB/WH/09應(yīng)該也無直接遺傳衍化關(guān)系，很可能是由境外傳入。初步推測(cè)，我國(guó)現(xiàn)有疫苗可能對(duì)該毒株保護(hù)力有限。因此，研究該毒株的細(xì)胞表位、發(fā)展相應(yīng)疫苗具有重要意義。

該研究采用多種在線表位預(yù)測(cè)軟件來預(yù)測(cè)CTL表位。其中，BIMAS［8］和 SYFPEITHI正是采用矩陣方法開發(fā)的。IEDB中，MHC-I類結(jié)合預(yù)測(cè)工具則是綜合了ANNS(人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))［9-12］、SMM(穩(wěn)定矩陣法)［13］、AMMPMBEC(肽段-MHC結(jié)合能力與穩(wěn)定矩陣法)［14］、CombLib(組合庫矩陣法)［15］、Consensus(共 識(shí) 表 位 預(yù) 測(cè) 方 法)［16］、NeMHC-pan［17-18］、PickPocket(結(jié)合槽選擇法)［19］、NetMHCcons(肽段-MHC結(jié)合預(yù)測(cè)綜合算法)［20］等多種肽段結(jié)合預(yù)測(cè)方法，而NetMHC-3.2則是結(jié)合了人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和權(quán)重矩陣2種方法。計(jì)算機(jī)表位預(yù)測(cè)在CTL抗原表位預(yù)測(cè)方面取得了很多成果。Gao等使用SYFPEITHI和GENETXY軟件預(yù)測(cè)O型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1上表位，然后將預(yù)測(cè)的候選表位同重組、表達(dá)SLA-2-(G4S)3-β2m蛋白復(fù)合體結(jié)合，分析候選表位同SLA-2-(G4S)3-β2m蛋白復(fù)合體的結(jié)合能力，結(jié)果表明表位26–34(RRQHTDVSF)和157-165(RTLPTSFNY)為FMDV CTL表位［21］。Barfoed等用SYFPEITHI和BIMAS軟件預(yù)測(cè)候選表位，然后構(gòu)建了可表達(dá)2C蛋白和預(yù)測(cè)出的候選表位的質(zhì)粒的DNA疫苗來免疫小鼠，通過胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法來檢測(cè)免疫后小鼠CD8+細(xì)胞IFN-γ的合成，結(jié)果表明FMDV C-S8c1株2C蛋白上的第63～71位(KYKDAKEWL)是H-2-Kd限制性CTL表位［22］。Liu等利用BIMAS軟件預(yù)測(cè)FMDV AF/72結(jié)構(gòu)蛋白VP1的H-2d限制性T細(xì)胞候選表位，并且化學(xué)合成這些候選表位，然后用表達(dá)FMDV AF/72結(jié)構(gòu)蛋白VP1免疫小鼠，將分離的免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞與候選表位體外共培養(yǎng)，采用T細(xì)胞增殖試驗(yàn)和IFN-ELISPOT試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明pK1(AYHKGPFTRL)是H-2Kd限制性T細(xì)胞表位pD7(GFIMDRFVKI)是H-2Dd限制性T細(xì)胞表位［23］。Gao等使用MetMHCpan-2.0和GENETYX預(yù)軟件預(yù)測(cè)的O型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1上的T細(xì)胞候選表位化學(xué)合成后，用脂質(zhì)體包裹來免疫小鼠，并進(jìn)行T細(xì)胞增殖試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、IFN-ELISA、CTL試驗(yàn)、豚鼠免疫保護(hù)力試驗(yàn)及組織病理學(xué)觀察，結(jié)果表明肽段VP126–34(RRQHTDVSF)和VP157–165(RTLPTSFNY)是O型FMDV的CTL表位，并且用其免疫動(dòng)物可在一定程度上抵御口蹄疫病毒的攻擊［24］。

但是，計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)表位也有諸多局限性，比如預(yù)測(cè)蛋白構(gòu)象及表位遞呈過程等都是極其復(fù)雜的問題，需要累積大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并且理論預(yù)測(cè)和實(shí)際情況總有一定差距。這就需要將2種或者多種以上的預(yù)測(cè)方法結(jié)合起來，以提高表位預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率。該研究使用了5種預(yù)測(cè)軟件，結(jié)合多種算法，綜合考慮各個(gè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，最終選出10條候選表位。

CTL表位主要是由8～11個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的線性表位。CTL表位是由內(nèi)源性抗原在胞漿加工產(chǎn)生。內(nèi)源性抗原是在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和加工的蛋白，主要是細(xì)胞自身產(chǎn)生的蛋白、感染病毒或者細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的非細(xì)胞自身的蛋白和腫瘤蛋白等。蛋白酶體處理經(jīng)泛素化后的內(nèi)源性抗原，將其裂解成8～11個(gè)左右氨基酸殘基的肽段，再經(jīng)過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)的作用進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的MHCⅠ類分子上的抗原結(jié)合槽結(jié)合形成MHCⅠ-抗原肽復(fù)合物。然后，通過高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面，同CD8+T細(xì)胞上的TCR識(shí)別與結(jié)合，從而誘發(fā)CTL效應(yīng)。因此CTL表位要有一定的穩(wěn)定性，才能保證在整個(gè)加工、結(jié)合、遞呈和識(shí)別過程的順利進(jìn)行，起到誘發(fā)細(xì)胞免疫的效應(yīng)。因此，采用ProtParam軟件對(duì)候選表位進(jìn)行穩(wěn)定性分析。結(jié)果表明，pK1、pK4、pD2、pD4和pD5的不穩(wěn)定指數(shù)較高，分別為 44.00、68.57、42.26、51.69和43.31。因此，這5個(gè)候選表位可能不是CTL表位。

動(dòng)物機(jī)體是一個(gè)復(fù)雜的、受多因素影響的、不斷變化著的環(huán)境。筆者對(duì)候選表位所進(jìn)行預(yù)測(cè)是在體外根據(jù)已知的細(xì)胞表位的各種理化數(shù)據(jù)、氨基酸殘基出現(xiàn)的頻率等多種因素來進(jìn)行分析，其穩(wěn)定性則是根據(jù)各個(gè)氨基酸殘基理化性質(zhì)來分析。因此，預(yù)測(cè)分析的候選表位可能與實(shí)際情況存在差異，還需要進(jìn)行體內(nèi)外試驗(yàn)來鑒定。

該研究借助于計(jì)算機(jī)表位預(yù)測(cè)軟件和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析軟件來預(yù)測(cè)和分析口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株結(jié)構(gòu)蛋白VP1上可能存在的H-2d限制性T表位，結(jié)果表明有5條候選表位可能是CTL表位，包括H-2Kd限制性表位2條(第27-35、118-126位)、H-2Ld限制性表位1條(第43-51位)，以及H-2Dd限制性表位2條(第45-53、146-154位)。當(dāng)然，該研究預(yù)測(cè)的表位還需要體內(nèi)外試驗(yàn)來驗(yàn)證。

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