樊哲新，李寶坤，李開(kāi)雄，朱　敏，蔣琰潔，李王強(qiáng)，寧孔卵

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

新疆酸駝乳NSLAB的篩選及鑒定

樊哲新，李寶坤*，李開(kāi)雄*，朱敏，蔣琰潔，李王強(qiáng)，寧孔卵

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

以新疆牧民家庭自然發(fā)酵酸駝乳為原料，采用改良的ROGOSA培養(yǎng)基篩選出20株非發(fā)酵劑乳酸菌（Non Starter Lactic Acid Bacteria，NSLAB），以產(chǎn)酸、自溶度、氨肽酶活力、蛋白水解能力為指標(biāo)復(fù)篩性能優(yōu)良的NSLAB，為新疆特色干酪的現(xiàn)代化改造提供新的菌株資源。結(jié)果表明：從酸駝乳中復(fù)篩得到六株NSLAB（編號(hào)X-4、X-5、X-7、X-12、X-13、X-15）。據(jù)多元統(tǒng)計(jì)分析六株菌綜合得分X-5＞X-4＞X-15＞X-13＞X-12＞X-7。其中X-5ΔpH（24h）、自溶度、氨肽酶活力、蛋白水解能力分別為1.08%、28.26%、18.88、3.21U/mL，有較好的應(yīng)用前景?；诰晟砩匦?，結(jié)合16S rDNA基因序列分析，構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)明確其分類地位，X-4、X-5、X-13、X-15鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），X-7鑒定為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），X-12確定為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。

發(fā)酵乳制品，非發(fā)酵劑乳酸菌，酸駝乳，菌種篩選

非發(fā)酵劑乳酸菌（NSLAB）是干酪微生物中一種獨(dú)特的菌群，屬次生菌群。通過(guò)添加NSLAB加速干酪成熟已成為研究熱點(diǎn)［1］。干酪發(fā)酵過(guò)程N(yùn)SLAB的產(chǎn)酸、凝乳影響很??；在成熟過(guò)程中，通過(guò)直接代謝或釋放各種酶類到干酪中，從而影響干酪風(fēng)味及質(zhì)構(gòu)［2-3］。有研究發(fā)現(xiàn)NSLAB含有檸檬酸鹽代謝系統(tǒng)及脂蛋白酯酶，酯酶將脂肪分解為脂肪酸，脂肪酸轉(zhuǎn)化成其他的芳香組分，如甲基酮和內(nèi)酯，另外NSLAB中含有的肽酶、氨基肽酶可將酪蛋白分解為多肽和游離氨基酸，增強(qiáng)干酪的風(fēng)味［4-7］。但也有研究表明某些菌株會(huì)對(duì)干酪風(fēng)味產(chǎn)生消極影響。傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的最終質(zhì)量取決于發(fā)酵過(guò)程中主發(fā)酵劑和非發(fā)酵劑乳酸菌及其他菌的相互作用［8］。因此，篩選適宜的NSLAB就顯得非常重要。

近二十幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)NSLAB的組成，影響其生長(zhǎng)的因素等方面進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)原料乳和發(fā)酵乳品是篩選NSLAB的主要來(lái)源。NSLAB群體主要由嗜溫乳桿菌組成，部分片球菌屬、腸球菌屬及明串珠球菌屬也包括在內(nèi)［9］。董曉婉等［10］從新疆地區(qū)酸乳中分離出5株乳酸菌，但未對(duì)NSLAB進(jìn)行確認(rèn)。目前，尚未有從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中篩選NSLAB的研究報(bào)道。新疆地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品如酸奶、酥油、奶酪中微生物資源豐富，從中篩選NSLAB具有可行性。本研究通過(guò)改良的ROGOSA固體培養(yǎng)基從伊犁、博州地區(qū)采集的12份酸駝乳中篩選NSLAB。由于菌株的生物學(xué)特性具有相關(guān)性，故以菌株產(chǎn)酸能力、自溶度、氨肽酶活力和蛋白質(zhì)水解能力為指標(biāo)，通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)方法復(fù)篩出性能優(yōu)良的NSLAB，為研究NSLAB對(duì)干酪成熟過(guò)程中風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)的影響提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

12份酸駝乳樣品采集新疆牧民家庭傳統(tǒng)工藝制造，其中精河小海子1份、闊岱管護(hù)站1份、伊犁國(guó)營(yíng)牧場(chǎng)3份、那仁和布克牧場(chǎng)2份、伊克烏圖布拉格牧場(chǎng)2份、巴音傲瓦鄉(xiāng)3份，采集50mL酸駝乳樣品裝于無(wú)菌離心管內(nèi)，封嚴(yán)后放入車載冰箱于4℃運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；ROGOSA培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基等參照相關(guān)資料配制［11-12］，其中葡萄糖天津盛奧化學(xué)試劑有限公司；乳糖天津興復(fù)精細(xì)化工研究所；蛋白胨、酵母浸膏北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；麥芽糖、甘露糖上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；甘油、檸檬酸銨天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硝酸鈉天津天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠；無(wú)水碳酸鈉天津市北辰方正試劑廠；吐溫80天津市福晨化學(xué)試劑廠；硫酸鎂、硫酸錳天津市福晨化學(xué)試劑廠；牛肉膏、瓊脂粉北京奧博星生物技術(shù)公司；以上試劑均為分析純；細(xì)菌基因組總DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物柱式純化試劑盒北京全式金生物技術(shù)有限公司；溶菌酶、瓊脂糖Sigma公司；2×Taq PCR Master Mix廣州東盛生物科技有限公司；Gold View、T載體、DH5α寶生物工程有限公司；L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺、酪氨酸、其他常規(guī)試劑均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

電熱恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；高速冷凍離心機(jī)Eppendorf公司；PCR擴(kuò)增儀Techne公司；電熱蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫恒濕培養(yǎng)箱德國(guó)BINDER公司；超凈工作臺(tái)蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；凝膠成像儀美國(guó)Bio-Rad公司；細(xì)胞破碎儀昆山市超聲儀器有限公司；紫外可見(jiàn)光光度計(jì)美國(guó)GE Amersham Biosciences公司；pH計(jì)北京哈納科儀科技有限公司。

1.2NSLAB的初篩

將酸駝乳樣品用無(wú)菌的2%檸檬酸三鈉（w/v）乳化，并做10倍遞增稀釋，取10-2、10-3、10-4三個(gè)稀釋度，分別吸取200μL于調(diào)整的ROGOSA固體培養(yǎng)基（4g/100mL NaCl，pH5.0），30℃培養(yǎng)5d。根據(jù)菌落的顏色、大小、光澤、光滑度等，挑取單菌落劃線接種至MRS固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)1～2d，多次劃線分離純化，得到純菌株。進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體大小、形狀、排列方式，同時(shí)進(jìn)行接觸酶實(shí)驗(yàn)，參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》將革蘭氏染色陽(yáng)性、接觸酶陰性的菌株初步定為NSLAB。純菌株斜面保藏，同時(shí)用40%甘油保存，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3NSLAB的復(fù)篩

以菌株產(chǎn)酸能力、自溶度、氨肽酶活力和蛋白水解四個(gè)特性為指標(biāo)，采用多元統(tǒng)計(jì)法復(fù)篩。

1.3.1產(chǎn)酸能力測(cè)定將連續(xù)活化兩代的菌株按照3%（v/v）的接種量接種到150mL高溫瞬時(shí)滅菌的駝乳中，30℃培養(yǎng)24h。分別測(cè)定培養(yǎng)0、24h駝乳的pH，以ΔpH（24h）表示菌株的產(chǎn)酸能力。

1.3.2自溶度的測(cè)定［13］將連續(xù)活化兩代的菌株，低溫離心（10000r/min，5min，4℃），將收集到的菌體懸浮于磷酸鈉緩沖液（0.1mol/L，pH6.8）中，將菌體懸浮液吸光值（OD650）調(diào)整到0.4～0.6，30℃培養(yǎng)24h后測(cè)定OD650值。

式中，A1—菌體初始懸浮液吸光度值，A2—菌體培養(yǎng)24h吸光度值。

1.3.3氨肽酶活力的測(cè)定［14］用細(xì)胞破碎儀制備無(wú)細(xì)胞提取物，測(cè)定無(wú)細(xì)胞提取物氨肽酶活力。氨肽酶活性的測(cè)定以L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺為底物，參照Deborah和Storey的方法采用LNT法在405nm處測(cè)定酶活力，空白對(duì)照不放入菌液。在37℃每分鐘生產(chǎn)1μmol對(duì)硝基苯胺為一個(gè)酶活力單位，用U表示。

1.3.4蛋白水解能力的測(cè)定連續(xù)活化兩代的菌株以3%接種于12g/mL的脫脂乳中，30℃培養(yǎng)12h，以未接菌的脫脂乳作為空白。參照Frank，Church方法作適當(dāng)修改［15］，在340nm處測(cè)定培養(yǎng)物的吸光度，測(cè)定菌株蛋白水解能力。繪制0.1～3mmol/L酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出蛋白水解活性相當(dāng)于酪氨酸的量。在37℃每分鐘分解牛奶蛋白產(chǎn)生1μmol酪氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位，用U表示。

式中，K—酶液稀釋倍數(shù)；W—為生成酪氨酸量，μmol；V—反應(yīng)酶液體積，mL；t—反應(yīng)時(shí)間，min。

1.3.5數(shù)據(jù)分析由于菌株產(chǎn)酸能力、自溶度、氨肽酶活力和蛋白質(zhì)水解能力有一定的相關(guān)性，數(shù)據(jù)在一定程度上具有重疊性。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)此四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分（PCA）分析。

1.4NSLAB種屬的鑒定

1.4.1菌株生理生化特性對(duì)純菌株的生理生化特性的測(cè)定參照文獻(xiàn)進(jìn)行［11-12］。

1.4.2分子生物學(xué)鑒定

1.4.2.1純菌株DNA的提取按照細(xì)菌基因組總DNA提取試劑盒（全式金）說(shuō)明書(shū)的要求操作（略作改動(dòng)，第二步添加溶菌酶，水浴2h，用來(lái)破壞NSLAB的細(xì)胞壁）提取NSLAB菌株的DNA。

1.4.2.216S rDNA片段的PCR擴(kuò)增對(duì)NSLAB16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR采用50μL擴(kuò)增體系：DNA稀釋液2μL，上游、下游引物各2μL，2×PCR Mixture 25μL，ddH2O 19μL；上游引物為U968（5-AACGCGA AGAACCTTAC-3）和L1401（5-CGGTGTGTACAAGA CCC-3）。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，30個(gè)循環(huán)（94℃預(yù)變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s），72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用全式金純化試劑盒割膠純化回收后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α中。經(jīng)藍(lán)白斑初篩，再以T載體通用引物（M13-47和RV-M）進(jìn)行菌落PCR篩選，將陽(yáng)性克隆子送到上海捷瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用CHECK-CHIMERA篩除嵌合體，通過(guò)NCBI上的Blast程序進(jìn)行序列同源性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1NSLAB初篩結(jié)果

經(jīng)改良的ROGOSA選擇培養(yǎng)基分離純化，篩得20株菌株，菌落多呈現(xiàn)圓形、扁平或針尖狀，不透明或者半透明，表面光滑，白色或乳黃色。分離得到的桿菌細(xì)胞為短桿狀或長(zhǎng)桿狀；球菌細(xì)胞為圓形，以單個(gè)或成對(duì)出現(xiàn)。

圖1　菌株革蘭氏染色熒光顯微鏡圖片（100×）Fig.1　The images of fluorescence microscope from isolates of gram staining（100×）

2.2NSLAB復(fù)篩

2.2.1菌株產(chǎn)酸能力分析NSLAB是一種獨(dú)特的菌群，在干酪生產(chǎn)過(guò)程中，幾乎不產(chǎn)生酸，故篩選產(chǎn)酸能力弱或不產(chǎn)酸的菌株［2］。由圖2可知，X-8產(chǎn)酸能力最弱，ΔpH（24h）為0.66%，X-9、X-17、X-3的產(chǎn)酸能力較弱，ΔpH（24h）分別為0.71%、0.98%、0.98%；65%的菌株ΔpH變化在1.01%～1.08%之間，說(shuō)明了所分離的NSLAB在發(fā)酵過(guò)程對(duì)產(chǎn)酸貢獻(xiàn)不大。X-15產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，ΔpH為1.17%，X-4、X-16的ΔpH（24h）依次為1.16%、1.11%，雖然這三株菌株產(chǎn)酸能力相對(duì)較大，但依然符合NSLAB的生物特性。

圖2　20株NSLAB產(chǎn)酸力Fig.2　Change of pH in culture solution for 20 strains NSLAB

2.2.2菌株自溶能力分析干酪成熟過(guò)程中，NSLAB細(xì)胞死亡自溶，釋放出大量的胞內(nèi)酶并保持活性，這些酶可將乳中的蛋白質(zhì)降解為菌體生長(zhǎng)所必須的小肽和氨基酸，形成特定風(fēng)味物質(zhì)前體或者直接形成干酪的風(fēng)味［16］。但在發(fā)酵過(guò)程中菌株自溶又降低了NSLAB的活菌數(shù)，這可能會(huì)影響乳制品的發(fā)酵成熟。NSLAB的自溶特性是由菌株的性質(zhì)決定的，不同菌株的自溶性強(qiáng)弱有很大的差異。對(duì)干酪成熟有促進(jìn)作用的NSLAB要結(jié)合產(chǎn)酸能力來(lái)選擇。據(jù)圖3知，菌株自溶度在14.58%～32.02%范圍內(nèi)變化，有較大的差異。X-3自溶度高達(dá)32.02%，X-4、X-5、X-13、X-15的自溶度分別是24.31%、28.26%、26.21%、27.57%，自溶度最低的是X-1，僅為14.58%。

圖3　20株NSLAB自溶度Fig.3　The extent of autolysis of 20 strains NSLAB

2.2.3菌株氨肽酶活力分析NSLAB產(chǎn)生的肽酶具有降解疏水性氨基酸和降低苦味的潛力［17］，添加低產(chǎn)酸能力、高肽酶活力的菌株對(duì)干酪成熟具有重要作用。氨肽酶活力適當(dāng)?shù)腘SLAB添加到干酪生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)對(duì)酪蛋白及其降解產(chǎn)物的作用，提高干酪風(fēng)味和品質(zhì)。如圖4所示，X-8氨肽酶活力最高，是19.02U/mL，X-5與之活力相當(dāng)，為18.88U/mL；X-4和X-15氨肽酶活力相差不大，分別為13.63、13.21U/mL，明顯要低于X-8；X-2氨肽酶活力最低，僅為7.90U/mL。

圖4　20株NSLAB氨肽酶活力Fig.4　The aminopeptidase activity of 20 strains NSLAB

2.2.4菌株蛋白水解能力分析蛋白質(zhì)水解速率在很大程度上決定著干酪成熟期的長(zhǎng)短，加快蛋白質(zhì)水解速率可以縮短成熟時(shí)間。游離氨基酸的增加會(huì)增強(qiáng)干酪風(fēng)味的強(qiáng)度，對(duì)不同特色干酪形成獨(dú)特風(fēng)味起到積極作用。但如果菌株的蛋白水解能力太強(qiáng)，會(huì)使蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的某些小分子多肽具有苦味，影響了干酪的口味［18-20］。據(jù)圖5可看出，X-5蛋白水解活力最高，是3.21U/mL；X-2最低，是1.35U/mL；X-12、X-13蛋白水解能力相近，僅比X-5低0.2U/mL；X-15蛋白水解能力為2.64U/mL。篩選蛋白水解能力適中的菌株（蛋白水解能力在2.3～3.1U/mL之間），使干酪在成熟期產(chǎn)生較少的苦味多肽，使口味柔和，更利于我國(guó)消費(fèi)者接受。

表1　主成分的初始特征值及累積貢獻(xiàn)率Table 1　Initial characteristic values and cumulative contribution of principal components

圖5　20株NSLAB氨肽酶活力Fig.5　The proteolysis ability of 20 strains NSLAB

2.2.5NSLAB生物學(xué)特性多元統(tǒng)計(jì)篩選通過(guò)SPSS 19.0的PCA對(duì)四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行降維分析，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，前兩個(gè)主成分的特征值均大于1，其中第一主成分的方差貢獻(xiàn)率為47.467%，第二主成分的方差貢獻(xiàn)率為33.738%，累積方差貢獻(xiàn)率為81.207%。說(shuō)明這兩個(gè)主成分可以反應(yīng)原始變量的主要信息。

根據(jù)主成分載荷矩陣與特征向量之間的關(guān)系，計(jì)算出前兩個(gè)特征向量，得到兩個(gè)主成分表達(dá)式：F1=0.679X1+0.249X2+0.917X3+0.729X4；F2=0.408X1-0.889X2+0.044X3+0.629X4，其中X1～X4分別表示各原始變量經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)值。以各主成分的特征值占所提取主份特征值之和的比例作為權(quán)重系數(shù)，建立主成分綜合得分模型：F=0.584F1+0.416F2。根據(jù)主成分綜合得分模型，計(jì)算綜合得分值，并對(duì)其進(jìn)行排序（見(jiàn)表2）。篩選出六株優(yōu)良性狀的NSLAB，即X-4、X-5、X-7、X-12、X-13、X-15。

表2　20株NSLAB的主成分得分及排序Table 2　Principal component scores and ranking of 20 strains NSLAB

表3　NSLAB生理生化項(xiàng)目與糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)Table 3　Biochemical characteristics and fermentation of sugar of NSLAB

2.3NSLAB種屬的鑒定

2.3.1NSLAB菌株生理生化特性實(shí)驗(yàn)分別以干酪乳桿菌，乳酸乳球菌作為對(duì)照菌株，篩選得到的6株NSLAB進(jìn)行生理生化特性測(cè)定與糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3，表明X-4、X-5、X-13、X-15不可利用鼠李糖，但可發(fā)酵乳糖、麥芽糖、甘露糖和葡萄糖等，與Lb.plantarum（植物乳桿菌）性質(zhì)相近，故鑒定為L(zhǎng)b.plantarum（植物乳桿菌）。X-12不可利用乳糖、麥芽糖、蔗糖產(chǎn)酸，但可以利用鼠李糖，與P.acidilactici（乳酸片球菌）性質(zhì)相似。X-7可發(fā)酵利用阿拉伯糖、甘露糖，但不發(fā)酵甘露醇、山梨醇，與Lb.fermentum（發(fā)酵乳桿菌）性質(zhì)一致。

2.3.2菌株的16S rDNA基因序列通過(guò)對(duì)NSLAB 16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增，得到清晰的特異性條帶，片段大小為450bp左右，電泳圖譜結(jié)果如圖6所示。

圖6　菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.6　PCR amplification pattern of isolates 16S rDNA

復(fù)篩得到的6株NSLAB的16S rDNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比對(duì)，選擇與其相似性最高且有效發(fā)表的典型菌株的16S rDNA基因序列，結(jié)合常規(guī)生理生化鑒定，確定與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系最近的菌屬，使用Mega5.0的鄰接法（Neighbor-joinig）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖7），自展值（bootstrap）為1000。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出X-7與Lactobacillus fermentum親緣性最近，序列同源性為100%，該菌可鑒定為L(zhǎng)actobacillus fermentum；X-4、X-5、X-13和X-15與Lactobacillus plantarum親緣性最近，序列相似性為100%，確定為L(zhǎng)actobacillusplantarum；X-12與Pediococcus acidilactici親緣關(guān)系為99%，可將該菌定為Pediococcus acidilactici。

圖7　基于16S rDNA序列的6株菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.7　Phylogenetic tree of the 6 strains based on Partial16S rDNA sequences

3　結(jié)論

從新疆不同地區(qū)酸駝乳中篩選出6株具有優(yōu)良性狀的NSLAB（X-4、X-5、X-7、X-12、X-13、X-15），其中X-5的ΔpH（24h）、自溶度、氨肽酶活力、蛋白水解能力分別為1.08%、28.26%、18.88、3.21U/mL，是性能最優(yōu)良的NSLAB。16S rDNA基因序列比對(duì)結(jié)果與生理生化特性鑒定結(jié)果相吻合，X-4、X-5、X-13、X-15菌株鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），X-7菌株確定為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），X-12菌株認(rèn)定為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。由于NSLAB的不可預(yù)測(cè)性及本身的動(dòng)力學(xué)變化特性，今后應(yīng)綜合考慮干酪成熟期雜菌生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏和菌株自身特性等因素對(duì)NSLAB促進(jìn)干酪成熟的影響，并嘗試從基因角度分析NSLAB影響干酪風(fēng)味的機(jī)理。

［1］El-Soda M A，Hantira A A，Ezzat N I，et al.Accelerated ripening of ras cheese using freeze-shocked mutant strains of Lactobacillus casei［J］.Food Chemistry，1992，44：179-184.

［2］Luca Settanni，Giancarlo Moschetti.Non-starter lactic acid bacteria used to improve cheese quality and provide health benefits［J］.Food Microbiology，2010，27：691-697.

［3］Fran?oise Irlinger，Jér?me Mounier.Microbial interactions in cheese：implications for cheese quality and safety［J］.Current Opinion in Biotechnology，2009，20：142-148.

［4］Palles，Beresford，Condon，et al.Citrate metabolism in Lactobacillus casei and Lactobacillus plantarum［J］.Journal of Applied Microbiology，2002，85（1）：147-154.

［5］Collins Y F，McSweeney P L H，Wilkinson M G.Lipolysis and free fatty acid catabolism in cheese：a review of current knowledge［J］.International Dairy Journal，2003，13：841-866.

［6］Upadhyay V K，McSweeney P L H，Magboul A A A，et al. Proteolysis in cheese during ripening［J］.In Cheese：Chemistry，Physics and Microbiology，2004，1（3）：391-434.

［7］Vassiliadis A，Psoni L，Snikolaou S，et al.Changes in microbial populations，kindsoflacticacidbacteriaandbiochemical characteristics of Greek traditional feta cheese during ripening［J］. International Journal of Dairy Technology，2009，62（1）：39-47.

［8］Bassirou Ndoye，Eric Andriamahery Rasolofo，Gisele LaPointe，et al.A review of the molecular approaches to investigate the diversity and activity of cheese microbiota［J］.Dairy Science& Technol，2011，91：495-524.

［9］Michael G Casey，Jean Pierre H?ni，Josef Gruskovnjak，et al. Characterisation of the non-starter lactic acid bacteria（NSLAB）of Gruyère PDO cheese［J］.Lait，2006，86（6）：407-414.

［10］董曉婉，李寶坤，盧士玲，等.傳統(tǒng)分離培養(yǎng)結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)分析傳統(tǒng)乳品中的乳酸菌［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2014（3）：97-101.

［11］東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：364-385.

［12］凌代文.乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999：1-25.

［13］Girbe Buist，Harma Karsens，Arjen Nauta，et al.Autolysis of Lactococcus lactis caused by induced overproduction of its major autolysin，acma.［J］.Appl Environ Microbiol，1997，63（7）：2722-2728.

［14］Deborah S，Storey R.Proteolytic and trypsin inhibitor activity in germinating jojoba seeds（simmondsia chinensis）［J］.Plant Physiology，1981，68（6）：1339-1344.

［15］Church F C，Swaisgood H E，Porter D H.Spectrophotometric assay using o-phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins［J］.Journal of Dairy Science，1983，66（6）：1219-1227.

［16］王秋宇.添加修飾的植物乳桿菌對(duì)契達(dá)干酪成熟的影響［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013：13-16.

［17］趙建.半硬質(zhì)干酪附屬發(fā)酵劑的篩選及其對(duì)干酪風(fēng)味影響的研究［D］.江蘇：江南大學(xué)，2007：10-13.

［18］Paolo Pirainoa，Teresa Zottaa，Annamaria Ricciardia，et al. Acid production，proteolysis，autolytic and inhibitory properties of Lactic acid bacteria isolated from pasta filata cheeses：amultivariate screening study［J］.International Dairy Journal，2008，18：81-92．

［19］Law J，F(xiàn)itzgerald G F，Daly C，et al.Proteolysis and flavor development in cheddar cheese made with the single starter strains Lactococcus lactis ssp.lactisUC317 or Lactococcus lactis ssp cremoris HP［J］.Journal of Dairy Science，1992（75）：1173-1185.

［20］倪春梅.乳酸菌分離篩選及其對(duì)新型半硬質(zhì)干酪品質(zhì)特性影響［D］.內(nèi)蒙古：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013：9-16.

Screening and identification of NSLAB in Xinjiang acid camel milk

FAN Zhe-xin，LI Bao-kun*，LI Kai-xiong*，ZHU Min，JIANG Yan-jie，LI Wang-qiang，NING Kong-luan
（College of Food Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

A total of 20 strains Non Starter Lactic Acid Bacteria（NSLAB）were isolated from home-made fermented camel milk samples of Xinjiang through improved ROGOSA medium.Comprehensive 4 physiological indices including the ability of acidity and the proteolysis，extent of autolysis，the aminopeptidase activity，of NSLAB were used to evaluate the composite score and select evaluation indices in tested high properties NSLAB.By multivariate statistical analysis and composite scores（X-5＞X-4＞X-15＞X-13＞X-12＞X-7）.The results showed that ΔpH（24h），the extent of autolysis，the aminopeptidase activity，the proteolysis ability of X-5 were 1.08%，28.26%，18.88，3.21U/mL，respectively.The isolates were identified by physiology-biochemistry characteristics and the molecular method of 16S rDNA and a phylogenetic tree was contructed.X-4，X-5，X-13，X-15 were identified as Lactobacillus plantarum，X-7，X-12 were identified as Lactobacillus fermentum，Pediococcus acidilactici，respectively.

fermented milks；Non Starter Lactic Acid Bacteria（NSLAB）；fermented camel milk；screening

TS261.1

A

1002-0306（2015）12-0170-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.027

2014－09－15

樊哲新（1987-），女，在讀碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品加工與安全。

李寶坤（1979-），男，博士，副教授，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。李開(kāi)雄（1956-），男，教授，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。

國(guó)家自然基金青年項(xiàng)目（31201395）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)博士資金專項(xiàng)（2014BB005）；石河子大學(xué)高層次人才啟動(dòng)項(xiàng)目（RCZX201223）；國(guó)家自然基金地區(qū)項(xiàng)目（31460007）；國(guó)家自然基金地區(qū)項(xiàng)目（30960001）。