劉智峰（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723000）

酶法-超聲波輔助提取香椿葉中總黃酮及抗氧化活性研究

劉智峰
（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723000）

研究了酶法-超聲波輔助提取香椿葉總黃酮的工藝條件及其抗氧化活性。通過Plackett-Burman篩選出影響最顯著的三個(gè)因素：纖維素酶用量、pH和超聲提取功率，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了香椿葉總黃酮的酶法-超聲波提取工藝條件，以香椿葉總黃酮提取液清除羥自由基和DPPH自由基來評(píng)價(jià)其抗氧化活性。得到的最佳工藝參數(shù)為：酶解溫度和超聲提取溫度均為60℃，料液比1∶30 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲提取時(shí)間40 min，纖維素酶用量8 mg/g，pH=5.6，超聲提取功率為220 W，此條件下香椿葉總黃酮得率達(dá)到33.166 mg/g?？寡趸Y(jié)果表明香椿葉總黃酮具有一定的抗氧化能力，香椿葉總黃酮提取液對(duì)羥自由基和DPPH自由基清除率的IC50分別為22.85、53.74μg/mL。

響應(yīng)面，總黃酮，香椿葉，抗氧化活性

香椿（Toona sinensis）是我國傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)速生樹種，目前主要以葉子作為香椿的經(jīng)濟(jì)支柱。香椿葉具有特殊的香味，作為綠色菜肴食用已經(jīng)有很長一段時(shí)間。香椿葉同時(shí)還具有一定的保健及預(yù)防疾病作用，可以作為天然的食品防腐劑、抗氧化劑使用。目前開發(fā)的香椿葉類相關(guān)產(chǎn)品包括香椿醬、香椿芽復(fù)合保健飲料等［1-4］。隨著研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)香椿葉的香味源于其中的活性成分總黃酮，李秀信等［5-9］對(duì)香椿葉中黃酮類成分進(jìn)行了定性分析和定量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示香椿葉中含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇等黃酮類化合物，在降血糖、抗氧化、抗痛風(fēng)、抗衰老方面具有突出效果，為開發(fā)香椿葉保健食品提供了理論依據(jù)。

目前已經(jīng)報(bào)道的香椿葉總黃酮提取方法有微波法、超聲波法、超臨界二氧化碳法、酶法等，其中酶法提取反應(yīng)溫和，在酶解作用下細(xì)胞膜破裂，傳質(zhì)阻力減小，加速了目標(biāo)提取物的溶出速率，提取效果好，一般無需其他外加能耗，工藝簡單，提取物的有效成分能得到很好的保護(hù)；超聲波法借助超聲波的空化及機(jī)械作用能有效促進(jìn)目標(biāo)提取物的溶出，超聲波的機(jī)械震動(dòng)還具有一定的殺菌及絮凝效果，有利于后期精制［10-11］。酶法輔-超聲波輔助提取香椿葉總黃酮在國內(nèi)未見報(bào)道，本文結(jié)合酶法和超聲波提取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，探究了提取過程中各因素對(duì)得率的影響，通過Blacket-Burman篩選出實(shí)驗(yàn)中影響較大的因素作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的影響因子對(duì)酶法-超聲波提取香椿葉黃酮進(jìn)行工藝優(yōu)化，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在為香椿葉在食品工業(yè)中的高效綜合利用提供理論參考。

1　材料及方法

1.1材料與儀器

香椿葉漢中植物園采摘，50℃恒溫干燥，粉碎過80目篩，陰涼干燥處保存待用；蘆丁中國藥品生物制品檢驗(yàn)所，純度≥98%；纖維素酶15000 U/g，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇、NaNO2、Al（NO）3、醋酸鈉、冰醋酸、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、抗壞血酸（VC）、2，2-二苯代苦味酰基苯肼基（DPPH）等均為分析純。

pHS-3TC（0.01級(jí)）精密酸度計(jì)上海天達(dá)儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9075A型電熱鼓風(fēng)箱上海一恒科技有限公司；Cary50型紫外可見分光光度計(jì)美國瓦里安；FW117中草藥粉碎機(jī)天津泰斯特儀器有限公司；SHZ-D9（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵鞏義市予華儀器有限公司；GR-200電子天平日本AND；80-1型離心機(jī)江蘇金壇正基儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制根據(jù)文獻(xiàn)采用NaNO2-Al（NO3）3比色法的測(cè)定結(jié)果繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線［12］。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)定的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程為：A=15.05C+ 0.0114，R2=0.9984，回歸方程中的A表示吸光度值，C表示蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，mg/mL。

1.2.2香椿葉總黃酮的提取將香椿葉粉末精密稱取1.000 g，倒入50 mL的錐形瓶中，按一定的料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇中，再加入緩沖液調(diào)節(jié)pH，在恒溫水浴槽中進(jìn)行酶解。酶解完成后轉(zhuǎn)移至設(shè)定好參數(shù)的超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行超聲波提取，得到的提取液經(jīng)過抽濾、2000 r/min離心6 min，取上清液作為提取液的最終測(cè)定樣本，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測(cè)定香椿葉總黃酮吸光度，計(jì)算得率。

1.2.3香椿葉總黃酮得率計(jì)算將測(cè)定的香椿葉總黃酮的吸光度A代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中求出提取液中的總黃酮濃度C，按下式計(jì)算得率。

式中：V—測(cè)定液的體積（mL）；C—香椿葉總黃酮測(cè)定樣品液濃度（mg/mL）；X—香椿葉總黃酮提取液稀釋總倍數(shù)；W—每次提取加入的香椿葉質(zhì)量（g）。

1.2.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選取影響酶法-超聲波輔助提取香椿葉中影響總黃酮得率的八個(gè)因素，在各因素實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)考察單因素水平變化對(duì)香椿葉總黃酮的得率的影響。

每次實(shí)驗(yàn)稱取1.0000 g香椿葉粉末，放入50 mL的錐形瓶中，加入乙醇溶液，添加纖維素酶，用緩沖液調(diào)節(jié)pH，一定溫度下酶解1 h后，設(shè)定超聲波提取條件進(jìn)行超聲波提取，考察各因素對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響。提取條件設(shè)定為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，纖維素酶用量8 mg/g，pH=5，超聲提取時(shí)間30 min，超聲提取功率120 W，超聲提取溫度60℃，料液比為1∶30 g/mL。在探究單因素對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響時(shí)分別變化對(duì)應(yīng)的設(shè)定因素，其他條件不變。

纖維素酶用量的考察水平分別為：2、5、8、11、14 mg/g；料液比的考察水平分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL；pH的考察水平分別為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5；超聲提取功率考察水平分別為120、150、180、210、240 W；酶解溫度考察水平分別為40、50、60、70、80℃；超聲提取溫度分別為40、50、60、70、80℃；乙醇體積分?jǐn)?shù)考察水平分別為50%、60%、70%、80%、90%；超聲提取時(shí)間的考察水平分別為20、30、40、50、60 min。

1.2.4.2Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)由于實(shí)驗(yàn)探究的單因素較多，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Blacket-Burman設(shè)計(jì)篩選出影響較大的幾個(gè)因素作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的影響因子，通過Plackett-Burman對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)的八個(gè)因素進(jìn)行考察，依次標(biāo)為A～H，每個(gè)因素取低水平“-1”和高水平“1”，響應(yīng)值為香椿葉總黃酮得率。因素水平表見表1。

表1　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels of Plackett-Burman

1.2.4.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選出的三個(gè)對(duì)香椿葉總黃酮得率影響較大的因素纖維素酶用量、pH、超聲提取功率作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的變量，香椿葉總黃酮得率作為響應(yīng)因子，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)因素水平表見表2。實(shí)驗(yàn)過程中其他影響不顯著的因素分別設(shè)定為：酶解溫度和超聲提取溫度均為60℃，料液比1∶30 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲提取時(shí)間40 min。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2　Factors and levels of central composition design test

1.2.5香椿葉總黃酮的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)研究

1.2.5.1清除羥自由基活性研究參照文獻(xiàn)［13-14］，將酶法-超聲波最佳工藝條件下提取的香椿葉總黃酮提取液配制成10、20、30、40、50、60、70、80、90 μg/mL質(zhì)量濃度的溶液九份，相同質(zhì)量濃度的VC作為對(duì)比，每個(gè)質(zhì)量濃度的提取液均取2.00 mL移入25 mL的容量瓶中，依次加入6.0 mmol/L的硫酸亞鐵2.0 mL，1.0 mmol/L的雙氧水2.0 mL混合均勻，靜置10 min后再加入6.0 mmol/L的水楊酸2.0 mL，反應(yīng)30 min于510.00 nm處測(cè)定吸光度，記為A0，用雙氧水代替水楊酸測(cè)得的吸光度記為A1，以蒸餾水代替提取液所測(cè)得的吸光度記為A2。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，以其平均值作為最終的實(shí)驗(yàn)值，按下式計(jì)算清除率。

1.2.5.2清除DPPH自由基活性研究參照文獻(xiàn)［14-15］，將酶法-超聲波最佳工藝條件下提取的香椿葉總黃酮提取液配制成10、30、50、70、90、110、130、150、170 μg/mL質(zhì)量濃度的溶液九份，每個(gè)質(zhì)量濃度的溶液均取2.0 mL移入10 mL的具塞試管中，再加入2.0 mL濃度為0.06 mg/mL的DPPH自由基溶液（用60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶解0.06 mg的DPPH自由基，轉(zhuǎn)移到100 mL棕色的容量瓶中定容），混合均勻后反應(yīng)30 min，于4000 r/min離心10 min，取上清液在波長517.00 nm處測(cè)定吸光度，記為A0；另移取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的黃酮溶液于10 mL的具塞試管中，分別加入無水乙醇2.0 mL，在波長517 nm處測(cè)定其吸光度，記為A1；以2.0 mL 0.03 mg/mL的DPPH自由基溶液和2.0 mL無水乙醇反應(yīng)作為參比測(cè)定吸光度，記為A2，以VC作為對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定三次，取平均值作為最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。按下式計(jì)算清除率：

1.3數(shù)據(jù)分析

為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精確度，本實(shí)驗(yàn)中均采用五次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用軟件Oringe 8.0，IC50的計(jì)算采用Matlab2013版，回歸分析采用SAS 8.0。

2　結(jié)果與分析

圖1　纖維素酶用量對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響Fig.1　Effect of cellulase dosage on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1纖維素酶用量對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響纖維素酶能破壞香椿葉的細(xì)胞壁，有助于總黃酮的溶出。由圖1可知，纖維素酶用量在8 mg/g時(shí)香椿葉中總黃酮的得率最大，此時(shí)酶解比較完全；纖維素酶添加量較少，香椿葉的細(xì)胞壁破壞不完全，黃酮不能全部釋放出來；隨著纖維素酶用量的增多，酶解的同時(shí)也有一部分纖維附著在香椿葉顆粒表面，堵塞了黃酮的部分溶出通道［16］，因此得率略有減小，故8 mg/g纖維素酶的效果較好。

圖2　料液比對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響Fig.2　Effect of the solid to liquid ratio on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

2.1.2料液比對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響由圖2可知，并不是料液比越大得率越高。料液比在1∶30 g/mL時(shí)香椿葉總黃酮的得率最大，料液比較小，一方面?zhèn)髻|(zhì)速率小，另一方面酶在提取劑中分散太集中容易粘結(jié)，活性受到影響，因此提取效果不好；料液比增大得率不增反減，隨著提取劑量的增加，纖維素酶與底物的濃度也減小，酶解效果變差。高料液比溶劑耗量大且提取效果不明顯，對(duì)于優(yōu)化工藝來說沒有太大意義，因此1∶30 g/mL是最佳料液比。

圖3　pH對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響Fig.3　Effect of pH on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

2.1.3pH對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響由圖3可知，pH在3.5～5.5范圍內(nèi)香椿葉總黃酮得率不斷增大，pH=5.5時(shí)提取最大，之后得率明顯降低。過高或過低的pH均會(huì)影響纖維素酶的活性及構(gòu)象，同時(shí)pH也會(huì)影響底物的解離狀態(tài)，阻礙部分底物與纖維素酶的結(jié)合，直接影響酶解效果［17］。pH=5.5時(shí)纖維素酶的活性最好，利于香椿葉總黃酮的提取，因此，選擇pH= 5.5較好。

2.1.4超聲提取功率對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響由圖4可知，香椿葉總黃酮得率隨超聲提取功率的增大而增大，超過210 W后得率減小；超聲提取功率較弱產(chǎn)生的機(jī)械及空化效應(yīng)對(duì)細(xì)胞壁的破壞程度?。怀暡üβ蚀?，在強(qiáng)大機(jī)械振動(dòng)作用下，提取劑流動(dòng)加快導(dǎo)致超聲波的停留時(shí)間減小，同時(shí)空化總用增強(qiáng)后產(chǎn)生的大量無用空化泡會(huì)增加超聲波的散射衰減，因此得率降低。綜合來看，選擇210 W為較佳的超聲提取功率。

圖4　超聲提取功率對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響Fig.4　Effect of ultrasonic extract power on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

圖5　酶解溫度對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響Fig.5　Effect of enzymolysis temperature on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

2.1.5酶解溫度對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響溫度對(duì)酶的活性有著較大的影響，酶在適宜的溫度下才會(huì)有效的進(jìn)行酶解反應(yīng)，所以溫度是酶解過程中一個(gè)重要的影響因素。由圖5可知，酶解溫度在50～70℃之間，香椿葉總黃酮得率的增幅不是很明顯，但超過70℃之后得率下降。低溫不足以激發(fā)纖維素酶的活性，高溫又容易使纖維素酶失活而且能耗高，綜合考慮，60℃是較佳的酶解溫度。

圖6　超聲提取溫度對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響Fig.6　Effect of temperature of ultrasonic on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

2.1.6超聲提取溫度對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響從圖6香椿葉總黃酮得率與超聲提取溫度的關(guān)系圖中可以看出，超聲提取溫度對(duì)香椿葉總黃酮提取的影響沒有其他因素明顯，主要是因?yàn)榍捌诿附夥磻?yīng)的溫度適宜，有助于香椿葉總黃酮的提取，超聲波再次強(qiáng)化了提取效果，但在高溫下總黃酮中部分熱敏性物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，溫度超過60℃得率減小。選擇60℃作為較佳的超聲提取溫度。

圖7　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響Fig.7　Effect of ethanol volume fraction on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

2.1.7乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響由圖7可以看出，香椿葉總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大總體呈先增大后減小的趨勢(shì)。因?yàn)椴煌w積分?jǐn)?shù)的乙醇的極性不同，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%～70%之間，香椿葉總黃酮的得率增加不明顯，但從節(jié)省能耗方面考慮，選擇60%的乙醇體積分?jǐn)?shù)得率較大，且節(jié)省乙醇用量。

圖8　超聲提取時(shí)間對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響Fig.8　Effect of treatment time of ultrasonic on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

2.1.8超聲提取時(shí)間對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響從圖8可以看出，香椿葉總黃酮得率隨超聲提取時(shí)間的延長而增加，超聲提取時(shí)間在20～40 min范圍內(nèi)，總黃酮得率隨著時(shí)間的延長不斷增大，40 min后得率基本上保持不變，繼續(xù)延長超聲提取時(shí)間加大提取成本，40 min的超聲提取基本上能將香椿葉總黃酮提取完全，綜合來看，超聲提取時(shí)間選取40 min。

2.2Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

根據(jù)1.2.4.2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，采用SAS 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸分析，各因素的顯著性檢驗(yàn)見表4。

表3　N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3　The result of N=12 Plackett-Burman

表4　各因素的顯著性檢驗(yàn)Table 4　Significance test of each factor

Plackett-Burman回歸模型的p=0.024384＜0.05，模型顯著，具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由表3中的回歸系數(shù)及Pr＞|T|可知，八個(gè)因素中纖維素酶用量、pH和超聲提取功率對(duì)香椿葉總黃酮得率影響顯著，因此作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的三個(gè)影響因素進(jìn)行工藝優(yōu)化，其他因素在實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)定為單因素實(shí)驗(yàn)確定的最佳水平。

2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

按照Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。表5中1～12號(hào)是析因?qū)嶒?yàn)，用來檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臄M合度；13～15號(hào)為零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，用來估算實(shí)驗(yàn)誤差。

表5　Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Table 5　Box-Behnken design and response value

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中的三因素對(duì)香椿葉總黃酮得率的影響并非簡單的線性關(guān)系，因此采用SAS 8.0中的RSREG對(duì)表5中的結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，回歸方程方差分析結(jié)果見6。

表6　回歸方程方差分析結(jié)果Table 6　Results of analysis of variance of regression equation

利用RSREG對(duì)表5中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到的香椿葉總黃酮得率數(shù)學(xué)模型回歸擬合后的回歸方程為：

Y=33.231-0.881625X1+1.104375X2+1.102X3-5.28125X12-1.0445X1X2+2.28525X1X3-8.36575X22+ 1.04475X2X3-2.5395X32

從表6的回歸分析可知，回歸模型的顯著系數(shù)R2=0.9933，模型調(diào)整系數(shù)AdjR2=0.9813；方程的失擬項(xiàng)p=0.1168，大于顯著統(tǒng)計(jì)水平0.05，說明模型已經(jīng)盡量避免了失擬因素的影響，顯著系數(shù)表明99.33%的響應(yīng)都源自所選因素的變化，模型能解釋98.13%的響應(yīng)值的變化，因此可以判斷此模型擬合效果好，可靠性高，可用此回歸方程對(duì)香椿葉總黃酮的得率進(jìn)行預(yù)測(cè)。

一次項(xiàng)中pH和超聲提取功率對(duì)模型影響極顯著（p＜0.01），纖維素酶添加量對(duì)模型影響顯著（p＜0.05），各因素對(duì)香椿葉總黃酮得率影響的先后順序?yàn)椋簆H＞超聲提取功率＞纖維素酶用量，和Plackett-Burman篩選結(jié)果相吻合。二次項(xiàng)均體現(xiàn)出極顯著統(tǒng)計(jì)水平，從表6中還可看出X1和X3的交互作用極顯著，X1X2、X2X3的交互作用達(dá)到了0.05顯著統(tǒng)計(jì)水平，說明各因素之間并非簡單的線性關(guān)系，提取過程中要嚴(yán)格控制各因素的變化水平。

回歸模型預(yù)測(cè)的香椿葉總黃酮的最佳提取工藝條件為：纖維素酶用量0.00790172 g、pH=5.582168、超聲提取功率為216 W，其他條件設(shè)定均為單因素選取的最佳值?？紤]到實(shí)際的可操作性，將最佳工藝條件進(jìn)行修正，選擇纖維素酶用量8 mg/g、pH=5.6、超聲提取功率220 W，在此條件下提取3次，得率分別為33.147、33.026、33.324 mg/g，將得率的平均值33.166 mg/g作為最佳工藝條件下的香椿葉總黃酮得率，與預(yù)測(cè)值33.847 mg/g的誤差僅為2.01%，說明此模型的可靠性高，可用于香椿葉總黃酮酶法-超聲波提取模型預(yù)測(cè)。

圖9　清除羥自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.9　Result of the·OH scavenging test

2.4香椿葉總黃酮抗氧化活性研究

2.4.1香椿葉總黃酮清除羥自由基活性清除羥自由基活性實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果見圖9。由圖9可知，總黃酮和VC對(duì)羥自由基的清除效果均與質(zhì)量濃度呈正比關(guān)系，總體來看，VC清除羥自由基效果比香椿葉總黃酮提取液好。香椿葉總黃酮提取液的IC50為22.85 μg/mL，香椿葉總黃酮提取液質(zhì)量濃度在50～60 μg/mL范圍內(nèi)清除羥自由基能力大于VC，說明香椿葉總黃酮具有很好的清除羥自由基能力，作為綠色食品抗氧化劑及保健食品原料具有一定的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

圖10DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)Fig.10　Result of the DPPHo scavenging test

2.4.2清除DPPH自由基活性清除DPPH自由基活性實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如圖10所示。由圖10可以看出香椿葉總黃酮提取液清除DPPH自由基效果明顯比VC差。在低濃度范圍內(nèi)，隨著總黃酮提取液質(zhì)量濃度的增大，DPPH自由基的清除率增長較快，濃度大于110 μg/mL之后清除率基本不變，而大于此濃度下的VC的清除率依然增大。香椿葉總黃酮提取液的IC50為53.74 μg/mL。

3　結(jié)論

3.1對(duì)酶法-超聲波提取過程中的影響因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)分析，通過Plackett-Burman篩選了對(duì)實(shí)驗(yàn)影響顯著的三個(gè)因素，響應(yīng)面對(duì)酶法-超聲波提取香椿葉總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)：纖維素酶用量8 mg/g、pH=5.6、超聲提取功率為220 W，酶解溫度和超聲提取溫度均為60℃，料液比1∶30 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲提取40 min。酶法-超聲波提取香椿葉總黃酮得率達(dá)到33.166 mg/g，比單獨(dú)使用酶法提取高出34.22%［18］，耗時(shí)短，能耗低，值得在天然產(chǎn)物提取中推廣。

3.2抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明香椿葉總黃酮提取液對(duì)羥自由基及DPPH自由基具有一定的清除能力，清除效果與濃度呈正比關(guān)系，可作為天然食品抗氧化劑應(yīng)用。天然黃酮具有多種生物活性，作為食品添加劑具有一定的保健效果。香椿葉總黃酮在食品工業(yè)中應(yīng)用潛力巨大，后期還需進(jìn)一步的深入研究，開發(fā)香椿葉的潛在應(yīng)用價(jià)值。

［1］田迪英，楊榮華.香椿的抗菌作用研究［J］.食品工業(yè)科技，2002（11）：21-22.

［2］郎杰，崔娜，李娜.香椿的抗氧化保健成分研究［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29（10）：151-153.

［3］孔瑾，劉璽，宋照軍.香椿醬軟罐頭護(hù)色工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2005，26（12）：145-148.

［4］王安建，黃紀(jì)念，王繼紅.香椿芽復(fù)合保健飲料的研制［J］.食品工業(yè)科技，2006（4）：118-119.

［5］李秀信，張?jiān)好?，劉青利，?香椿葉中黃酮成分的分析鑒定［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，16（增）：86-88.

［6］張俊芳，楊加域，溫勁，等.香椿總黃酮降血糖作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中藥材，2008，31（11）：1712-1714.

［7］李貞景.香椿葉總黃酮的提取及其降血尿酸的研究［D］.天津：天津科技大學(xué)，2008.

［8］王昌祿，江慎華，陳志強(qiáng)，等.香椿老葉總黃酮提取工藝及其抗氧化活性的研究［J］.北京林業(yè)大學(xué)報(bào)，2008，30（40）：28-33.

［9］楊文旭，王昌祿，崔桂友，等.香椿葉總黃酮對(duì)延緩秀麗線蟲衰老影響的初步研究［J］.中國食品添加劑，2010（12）：143-46.

［10］陳叢瑾，黃克瀛，王貴武，等.香椿葉總黃酮不同提取方法的比較［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29（3）：57-60.

［11］方芳，許凱揚(yáng)，朱強(qiáng)，等.超聲波輔助水酶法萃取葫蘆籽油的研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2012，27（10）：62-66.

［12］李秀信，張?jiān)好?香椿葉總黃酮含量測(cè)定方法研究［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2010，10（5）：243-249.

［13］陳佳，徐懷德，米林峰，等.洋蔥皮總黃酮纖維素酶法提取及抗氧化研究［J］.食品科學(xué)，2011，32（4）：37-41.

［14］孟娜，魏勝華，陶玉貴，等.超聲波-酶法聯(lián)合提取絞股藍(lán)總黃酮及其抗氧化活性的研究［J］.食品工業(yè)科技，2014（3）：138-141.

［15］丁振柱，黃仁華，王丹.費(fèi)約果葉片總黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30（3）：371-375.

［16］高文秀，楊艷艷，趙文卓，等.復(fù)合酶解法協(xié)同超聲波法提取山楂中總黃酮的工藝條件優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（2）：175-179.

［17］王曉，李林波，馬小來，等.酶法提取山楂葉總黃酮的研究［J］.食品工業(yè)科技，2002，23（3）：37-38.

［18］陳叢瑾，黃克瀛，李德良，等.香椿葉總黃酮的酶法提取及其清除DPPH自由基能力的研究［J］.中成藥，2008，30（8）：1127-1131.

Study on enzymatic-ultrasonic assisted extraction of total flavonoids from Tone sinensis and its anti-oxidation activities

LIU Zhi-feng
（College of Chemistry&Environmental Science of Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China）

The extraction and anti-oxidation activities of total flavonoids from Toona sinensis leaves by enzymaticultrasonic were studied.Cellulase dosage，pH and ultrasonic power were screened out by Plackett-Burman as the significant affected factors.The optimum extraction conditions were established by using 3 factors and 3 levels response surface experiment.The result showed that the optimal extraction conditions of total flavonoids were the hydrolysis temperature and ultrasonic extraction temperature of 60℃，the solid-to-solvent of 1∶30 g/mL，the ethanol concentration of 70%，ultrasonic extraction time of 40 min，cellulase dosage of 8 mg，pH=5.6，ultrasonic extraction power of 220 W，the extraction rate under this condition reached 33.166 mg/g.The antioxidation activity experiments results showed that the IC50of·OH and DPPH·scavenging rate were 22.85 μg/mL and 53.74 μg/mL respectively.

response surface method；total flavonoids；Toona sinensis leaves；anti-oxidation activities

TS201.1

B

1002-0306（2015）20-0314-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.056

2015－02－09

劉智峰（1979-），男，碩士，研究方向：生物資源利用與環(huán)境保護(hù)，E-mail：lzhifeng2005@163.com。

陜西省科技廳社發(fā)攻關(guān)基金（2011K17-03-10）；陜西理工學(xué)院科研項(xiàng)目（SLGKY14-11）。