劉小路，薛　璐，*，魯曉翔，張　鵬，陳紹慧，李江闊

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134；2.國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384）

近紅外光譜技術(shù)快速無(wú)損檢測(cè)藍(lán)莓總黃酮、花青素的研究

劉小路1，薛璐1，*，魯曉翔1，張鵬2，陳紹慧2，李江闊2

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134；2.國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384）

為建立起藍(lán)莓的快速無(wú)損檢測(cè)體系，本研究應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)對(duì)鮮藍(lán)莓中總黃酮、花青素的含量進(jìn)行了分析。在光譜全波長(zhǎng)（400～2500 nm）范圍內(nèi)采用偏最小二乘法（PLS）建立藍(lán)莓總黃酮、花青素含量的定標(biāo)數(shù)學(xué)模型，其相關(guān)系數(shù)分別為0.836和0.750，校正標(biāo)準(zhǔn)誤差（SECV）分別為1.423 mg/（100g）和4.688 mg/（100g）。然后使用最優(yōu)模型對(duì)32個(gè)未知樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)，其預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)Rp2分別為0.7968和0.7902，預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為2.779 mg/（100g）和5.013 mg/（100g），殘差和分別為-0.003 mg/（100g）和-9.256（mg/100g）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，近紅外漫反射技術(shù)可用于快速無(wú)損檢測(cè)藍(lán)莓中總黃酮、花青素含量。

近紅外光譜技術(shù)，藍(lán)莓，總黃酮，花青素，無(wú)損檢測(cè)

藍(lán)莓（Blueberry）學(xué)名為越桔（Vaccinium ssp），屬于杜鵑花科（Ericaseae）越桔屬（Vaccinium）落葉或常綠灌木植物，果肉細(xì)膩，甜中帶酸，風(fēng)味獨(dú)特，適于鮮食。藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，除含有糖、酸外，還富含多種維生素（VC、VE、VA、VB等）、SOD、熊果苷、花色苷、蛋白質(zhì)、豐富的食用纖維以及黃酮類等特殊成分。藍(lán)莓中黃酮類物質(zhì)作為生物活性成分，在抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、改善視力等方面有一定的作用［1］。

黃酮類物質(zhì)及花青素等傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有水浸提法、有機(jī)溶劑浸提法、回流提取法等，這些方法耗時(shí)長(zhǎng)，污染環(huán)境，無(wú)法滿足生產(chǎn)過(guò)程中在線成分含量監(jiān)控的要求。因此簡(jiǎn)單、快速、高效的檢測(cè)方法廣泛受到關(guān)注。近紅外光譜技術(shù)作為一種快速、無(wú)損的檢測(cè)技術(shù)，在水果品質(zhì)檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用［2-6］。王姍姍等［7-8］曾利用近紅外光譜技術(shù)對(duì)超低溫貯藏（-170℃）的藍(lán)莓進(jìn)行無(wú)損檢測(cè)，對(duì)藍(lán)莓SSC、總酚和花青素建立數(shù)學(xué)模型。劉燕德等［9］應(yīng)用可見(jiàn)/近紅外漫反射光譜對(duì)南豐蜜桔維生素C含量進(jìn)行了無(wú)損檢測(cè)研究。雖然近幾年近紅外應(yīng)用廣泛，但是在鮮食藍(lán)莓總黃酮、花青素含量測(cè)定方面的研究較少。本課題研究了低溫貯藏（0℃）條件下，利用近紅外光譜技術(shù)建立鮮食藍(lán)莓總黃酮、花青素含量的無(wú)損檢測(cè)模型，通過(guò)對(duì)模型的校正、驗(yàn)證，獲得準(zhǔn)確性較高的模型，為以后鮮食藍(lán)莓的品質(zhì)鑒定提供理論依據(jù)及方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

藍(lán)莓品種伯克利，于2014年7月采自大連金州基地，采摘當(dāng)天將果實(shí)運(yùn)回國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室（溫度為25～30℃）進(jìn)行處理。低溫（0℃）預(yù)冷24 h后進(jìn)行分裝（0.05 mm的PE膜），封口，然后放在低溫庫(kù)（0℃）中貯藏，樣品從采摘當(dāng)天開(kāi)始測(cè)定，到低溫貯藏64 d藍(lán)莓變軟、腐爛率達(dá)到50%停止測(cè)定，其間每8 d進(jìn)行測(cè)定，共測(cè)8次。

NIRSDS2500近紅外漫反射光譜儀丹麥FOSS公司；TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)普析通用儀器有限公司；SHZ-82A水浴恒溫鍋金壇市金南儀器制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1藍(lán)莓樣品處理實(shí)驗(yàn)前，將處理的藍(lán)莓取出，置于常溫環(huán)境下1.5 h，恢復(fù)至室溫，每次實(shí)驗(yàn)取20組，每組4個(gè)果實(shí)。每組藍(lán)莓標(biāo)記后四果同時(shí)進(jìn)行光譜掃描，然后將掃描后的藍(lán)莓果實(shí)進(jìn)行化學(xué)指標(biāo)的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)共取160個(gè)，隨機(jī)分為定標(biāo)集和驗(yàn)證集，樣品數(shù)分別為128個(gè)和32個(gè)。

1.2.2光譜的采集本實(shí)驗(yàn)使用儀器是丹麥FOSS公司提供的NIRS DS2500近紅外漫反射光譜儀，采用全息光柵分光系統(tǒng)，硅（400～1100 nm）和硫化鉛（1100～2500 nm）檢測(cè)器采集信號(hào)。光譜采集條件為：在波長(zhǎng)范圍400～2500 nm內(nèi)，單波長(zhǎng)快速掃描，掃描次數(shù)32。儀器配制Nova分析軟件采集光譜，WinISI4定標(biāo)軟件處理光譜數(shù)據(jù)，測(cè)量時(shí)盡量避開(kāi)表面缺陷部位（如傷疤、污點(diǎn)等），因藍(lán)莓果實(shí)較小，光譜掃描時(shí)采用每組四果同時(shí)掃描，盡量將透光孔遮住，在小漿杯（Slurry Cup）上藍(lán)莓果實(shí)均豎放，避開(kāi)果蒂進(jìn)行光譜掃描。

1.2.3測(cè)定方法

1.2.3.1樣品液的制備每組四個(gè)藍(lán)莓新鮮果肉各取一部分，共稱取5 g左右，研磨后放于250 mL的燒杯中，用60%的乙醇定容至100 mL，搖勻，放在80℃的水浴鍋浸提15 min，取出，放置至漂浮物沉下為止，備用。

1.2.3.2總黃酮含量的測(cè)定

a.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（0.08 mg/mL）0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL于試管中，用30%乙醇定容至5 mL，混勻，分別加入0.3 mL 5%NaNO2，混勻靜置5 min，加0.3 mL 10%Al（NO3）3，混勻靜置5 min，加入4 mL 1 mol/L NaOH，再加入0.4 mL 30%乙醇使總體積達(dá)到10 mL，混勻靜置10 min，在510 nm處比色，以蒸餾水為空白對(duì)照，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

b.總黃酮含量的測(cè)定：取1 mL提取液，加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻靜置5 min，加入0.3 mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻，放置5 min，加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液，用30%的乙醇定容到10 mL，混勻靜置10 min。以蒸餾水作為空白對(duì)照，在其最大吸收波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度A值［10-11］。計(jì)算公式為：

其中：X—由回歸方程求得；V1—提取液總體積；V2—測(cè)定用樣品液體；W—樣品鮮重。

1.2.3.3花青素含量的測(cè)定取制備的樣品液兩份，各2 mL，分別加入pH 4.5的0.4 mol/L的醋酸鈉緩沖液和pH 1.0的0.25 mol/L的氯化鉀緩沖液8 mL，搖勻，放置半小時(shí)，轉(zhuǎn)入光路長(zhǎng)1 cm的比色皿后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別以530 nm和700 nm為吸收波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度，用60%乙醇做空白對(duì)照［12］。計(jì)算公式為：

其中：A—最終吸光度；M—摩爾質(zhì)量：449.2；F—樣品液稀釋倍數(shù)；V—稀釋總體積：mL；e—摩爾吸光系數(shù)：26900；L—比色皿光路長(zhǎng)：1 cm；m—樣品鮮重：g。

1.3光譜數(shù)據(jù)處理與分析

為了比較不同光譜預(yù)處理方法對(duì)所建模型的影響，利用WinISI4定標(biāo)軟件，對(duì)原始光譜進(jìn)行濾波和平滑處理，以去除噪聲，提取有效信息。本實(shí)驗(yàn)中總黃酮、花青素均采用PLS法，分別研究不同導(dǎo)數(shù)處理與不同散射和標(biāo)準(zhǔn)化方法相結(jié)合的處理方法對(duì)模型的影響，通過(guò)比較找到最優(yōu)的模型。在全光譜范圍內(nèi)，討論了原始光譜（None）、一階導(dǎo)數(shù)（D1Log（1/R））、二階導(dǎo)數(shù)（D2Log（1/R））和標(biāo)準(zhǔn)正?；幚恚⊿NV）、去散射處理（Detrend）、標(biāo)準(zhǔn)正?；c去散射結(jié)合處理（SNV and Detrend）、標(biāo)準(zhǔn)多元離散校正（SMSC）和加權(quán)多元離散校正（WMSC）相結(jié)合的處理方法所建立的模型。然后再用未參與定標(biāo)的未知樣品對(duì)最優(yōu)定標(biāo)模型進(jìn)行驗(yàn)證，以評(píng)價(jià)模型的可行性。本實(shí)驗(yàn)以交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（Rcv2）和交互驗(yàn)證誤差（SECV）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。預(yù)測(cè)模型則通過(guò)預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)（Rp2）、預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEP）和殘差分析評(píng)價(jià)所建模型的精確性。

1.4預(yù)測(cè)模型殘差分析

預(yù)測(cè)效果和穩(wěn)定性較好的近紅外模型，要求殘差正、負(fù)值均勻分布在零點(diǎn)上下，且殘差之和接近于零。殘差公式如下［13］：

殘差e=y－y′

式中，y為通過(guò)數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)所得的樣品預(yù)測(cè)值；y′為用標(biāo)準(zhǔn)方法所得的樣品真實(shí)值。根據(jù)殘差分布和殘差和確定定標(biāo)模型的預(yù)測(cè)效果。

2　結(jié)果與討論

2.1低溫貯藏期間藍(lán)莓總黃酮、花青素含量標(biāo)準(zhǔn)值

藍(lán)莓在貯藏期間，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)莓中的化學(xué)成分在相關(guān)酶的作用下發(fā)生變化，導(dǎo)致果實(shí)中含氫官能團(tuán)變化。研究表明，近紅外光譜區(qū)吸收的官能團(tuán)主要是含氫官能團(tuán)，其中包括C-H、O-H、N-H和S-H等，一般情況下近紅外光譜帶的二級(jí)倍頻位于1100～1600 nm范圍內(nèi)，三級(jí)和四級(jí)倍頻位于780～1100 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)［14］。

表1是本實(shí)驗(yàn)總黃酮、花青素含量校正集和驗(yàn)證集的范圍、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。校正集用來(lái)建立數(shù)學(xué)模型，應(yīng)具有代表性，其組成要包含待測(cè)樣品所包含的所有化學(xué)組分，其變化范圍應(yīng)大于待測(cè)樣品的變化范圍。由表1可知，樣品驗(yàn)證集的含量范圍都在校正集范圍內(nèi)，因此，本實(shí)驗(yàn)樣品可以用于建立藍(lán)莓總黃酮、花青素含量的近紅外模型。

2.2藍(lán)莓近紅外原始光譜掃描

圖1為藍(lán)莓原始吸收光譜圖。從圖1中可以看出，光譜變化趨勢(shì)基本保持一致，但在波長(zhǎng)為680、975、1186、1448、1916 nm的吸收峰處有顯著差異。通過(guò)WinISI4定標(biāo)軟件分析可知，第一個(gè)吸收峰在680 nm處，主要是由于葉綠素對(duì)光的吸收造成的［15］；而975 nm和1186 nm處的吸收峰主要是因?yàn)樗趾康牟町愐鸬?，這說(shuō)明水分含量的多少對(duì)藍(lán)莓的近紅外光譜影響很大；吸收峰1448 nm附近主要是C-H、-CH2鍵發(fā)生變化導(dǎo)致的。因此，不同時(shí)間貯藏的藍(lán)莓能提供豐富的光譜信息，通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)提取有效的光譜信息，因而應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)建立藍(lán)莓總黃酮、花青素的定量模型具有可行性。

表1　藍(lán)莓總黃酮、花青素含量實(shí)測(cè)結(jié)果Table 1　Measured results of total flavonoids and anthocyanins in blueberries

圖1　藍(lán)莓原始光譜圖Fig.1　The original spectrum of blueberries

2.3總黃酮、花青素最佳光譜預(yù)處理方法的確定

NIRS采集的原始光譜除了含有與樣品本身組成相關(guān)的信息外，還可能受到測(cè)試條件、外界溫度、儀器狀態(tài)等因素的影響，而且樣品中不同成分間的相互干擾以及成分含量的不同都有可能導(dǎo)致光譜重疊，因此，對(duì)采集到的原始光譜進(jìn)行預(yù)處理是非常必要的，能過(guò)濾噪聲，提高信噪比，消除基線飄移的干擾［16］。用不同光譜預(yù)處理方法建模結(jié)果如表2所示。

表2　不同預(yù)處理的定標(biāo)結(jié)果Table 2　Calibration results of different pretreatment

圖2　總黃酮一階導(dǎo)數(shù)吸收光譜圖Fig.2　First derivative absorbance spectrum of total flavonoids

由表2可知：D1Log（1/R）的模型優(yōu)于None和D2Log（1/R）的模型，其SECV較小，Rcv2較大。對(duì)于總黃酮含量來(lái)說(shuō)，光譜導(dǎo)數(shù)處理對(duì)相關(guān)系數(shù)Rcv2影響較大?？傸S酮最佳處理?xiàng)l件為PLS+D1Log（1/R）+SNV and Detrend，其SECV為1.423，Rcv2為0.836；花青素最佳光譜處理?xiàng)l件為PLS+D1Log（1/R）+SMSC，其SECV為4.688，Rcv2為0.750。總黃酮、花青素處理后的光譜如圖2、圖3，從圖中可以看出，一階導(dǎo)數(shù)處理后的光譜圖不僅消除了儀器背景的干擾和基線漂移，還去除了樣品不同組分之間相互干擾造成的光譜重疊現(xiàn)象，使光譜中的有用信息更加清晰的顯示出來(lái)，具有更清晰的光譜輪廓變化和分辨率。因此，實(shí)驗(yàn)研究均采用一階導(dǎo)數(shù)處理。

2.4定標(biāo)模型的驗(yàn)證

預(yù)測(cè)模型通過(guò)預(yù)測(cè)樣本誤差（SEP）和相關(guān)系數(shù)Rp2評(píng)價(jià)與對(duì)比所建模型的精確性。Rp2值越大，SEP越小，表明模型的預(yù)測(cè)能力越強(qiáng)。

圖3　花青素一階導(dǎo)數(shù)吸收光譜圖Fig.3　First derivative absorbance spectrum of anthocyanins

為了驗(yàn)證模型的可靠性和穩(wěn)定性，用未知的32個(gè)樣品對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖4～圖5所示。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，總黃酮的Rp2為0.7968，SEP為2.779；花青素的Rp2為0.7902，SEP為5.013。可見(jiàn)本實(shí)驗(yàn)相關(guān)性不高，其中總黃酮的模型優(yōu)于花青素模型，主要是因?yàn)樗{(lán)莓果實(shí)較小，四果掃描取平均光譜，其果實(shí)間的差異可能會(huì)導(dǎo)致光譜偏差較大，而且藍(lán)莓中花青素的含量高于總黃酮，測(cè)定時(shí)果實(shí)之間的差異對(duì)含量的影響很大，同時(shí)紫外分光光度計(jì)的儀器誤差以及測(cè)定過(guò)程中的人為誤差都會(huì)影響含量的實(shí)測(cè)值，因此，為了得到準(zhǔn)確性更高的定標(biāo)模型還需要進(jìn)一步的優(yōu)化與完善。

2．5總黃酮、花青素模型殘差分析

使用所建的定標(biāo)模型預(yù)測(cè)32個(gè)未知樣品，考察模型的預(yù)測(cè)能力。圖6～圖7為驗(yàn)證樣品殘差分布圖。

圖4　藍(lán)莓總黃酮實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性Fig.4　Correlation between predicted values of model optimized and actual values of blueberry total flavonoids

圖5　藍(lán)莓花青素實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性Fig.5　Correlation between predicted values of model optimized and actual values of blueberry anthocyanins

圖6　驗(yàn)證集樣品總黃酮實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的殘差分布圖Fig.6　Distribution of residual error of measured value and predicted value of validation samples total flavonoids

圖7　驗(yàn)證集樣品花青素實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的殘差分布圖Fig.7　Distribution of residual error of measured value and predicted value of validation samples anthocyanins

由圖6、圖7可知，從分布上看，總黃酮的殘差分布較均勻，花青素的殘差分布較分散；從其殘差和考慮，32個(gè)樣品的總黃酮、花青素的殘差和分別為-0.003 mg/100g和-9.256 mg/100g，總黃酮的殘差和更趨于零。綜上所述，通過(guò)比較預(yù)測(cè)模型相關(guān)系數(shù)Rp2、預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEP）、殘差分布和殘差和這四項(xiàng)指標(biāo)的分析結(jié)果，表明：藍(lán)莓總黃酮含量的定標(biāo)模型預(yù)測(cè)效果優(yōu)于花青素的定標(biāo)模型。

3　結(jié)論

藍(lán)莓貯藏期間，總黃酮和花青素的含量是反映藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的指標(biāo)。本研究在全波長(zhǎng)（400～2500 nm）范圍內(nèi)應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)建立藍(lán)莓總黃酮、花青素的無(wú)損檢測(cè)模型。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用同時(shí)測(cè)定藍(lán)莓總黃酮和花青素含量，有效縮短傳統(tǒng)分析方法的時(shí)間，降低藍(lán)莓的損耗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，32個(gè)未知樣品總黃酮、花青素的預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)Rp2分別為0.7968和0.7902，預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEP）分別為2.779 mg/（100g）和5.013 mg/（100g），殘差和分別為-0.003 mg/（100g）和-9.256 mg/（100g）。通過(guò)比較預(yù)測(cè)模型相關(guān)系數(shù)Rp2、預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEP）、殘差分布和殘差和四項(xiàng)指標(biāo)，說(shuō)明今后仍需要對(duì)近紅外快速無(wú)損檢測(cè)藍(lán)莓品質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化和完善。

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Fast non-destructive testing of total flavonoids and anthocyanins in blueberries by near-infrared spectroscope

LIU Xiao-lu1，XUE Lu1，*，LU Xiao-xiang1，ZHANG Peng2，CHEN Shao-hui2，LI Jiang-kuo2
（1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；2.Tianjin Key Laboratory of Postharvest Physiology and Storage of Agricultural Products，National Engineering and Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products，Tianjin 300384，China）

In order to establish the fast non-destructive testing of blueberry，the total flavonoids and anthocyanins in fresh blueberry were analyzed by near infrared spectroscope（NIRS）.In the spectral region between 400～2500 nm，statistical mathematical models of total flavonoids and anthocyanins in blueberry were established within broad spectrum（400～2500 nm）using the partial least squares（PLS）.The correlation coefficient were 0.836 and 0.750 respectively，and the standard errors for calibration（SECV）were 1.423 mg/（100g）and 4.688 mg/（100g）respectively.Then 32 unknown samples were predicted by the optimal models.The correlation coefficient of prediction（Rp2）were0.7968 and 0.7902 respectively，and the standard errors of prediction（SEP）were 2.779 mg/（100g）and 5.013 mg/（100g）respectively，and residual sum were-0.003 mg/（100g）and-9.256 mg/（100g）respectively.The results showed that near infrared spectroscope could be used in fast non-destructive testing of total flavonoids and anthocyanins in blueberries.

near infrared spectroscopy；blueberry；total flavonoids；anthocyanins；non-destructive testing

TS255.1

A

1002-0306（2015）16-0058-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.003

2014－12－16

劉小路（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏，E-mail：Liuxiaolu0316@163.com。

薛璐（1976-），女，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏，E-mail：hellenxue@sina.com。

國(guó)家（十二五）科技支撐計(jì)劃（2012BAD38B01）；天津市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（TD12-5049）。