邱蓉麗，吳玉蘭，樂 巍

(南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京 210023)

陳皮和青皮均為中醫(yī)臨床常用理氣藥，陳皮來源于蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的成熟果皮，青皮來源于橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的幼果和未成熟果皮。雖然兩者原植物相同，但由于采收時間不同，其臨床功效差異較大。古人對此早有認識，陳嘉漠《本草蒙荃》曰“青皮、陳皮一種，因其遲早采收，特分老嫩而立名也。嫩者性酷治下，老者性緩治高”;李時珍在《本草綱目》中描述“陳皮浮而升，入脾肺氣分;青皮沉而降，入肝膽氣分，一體二用”［1］。

陳皮、青皮中主要含兩種類型的黃酮類成分:一類是黃酮苷類，如柚皮苷、橙皮苷等二氫黃酮苷類;一類是多甲氧基黃酮類，有橘皮素、川陳皮素等［2-4］?！吨袊幍洹?010年版僅以橙皮苷作為指標性成分評價陳皮及青皮的質量［5］。為了更好地比較青皮、陳皮藥材中黃酮類成分的差異及其對功效的影響，本實驗選擇2個黃酮苷 (柚皮苷、橙皮苷)、2個多甲氧基黃酮 (橘皮素、川陳皮素)作為指標比較不同產地陳皮、青皮中黃酮，為解釋陳皮、青皮“一體二用”的機理提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀;Waters 2996二極管陣列檢測器。

1.2 材料 陳皮、青皮藥材分別收購于浙江，湖北，廣東。浙江、湖北產陳皮、青皮經南京中醫(yī)藥大學藥學院樂巍副教授鑒定為橘Citrus reticulata Blanco的干燥成熟果皮及干燥幼果。廣東產陳皮、青皮購于廣東新會，經鑒定為茶枝柑Citrus retculata Chachi的干燥成熟果皮及干燥幼果。橙皮苷(hesperidin)、柚皮苷 (naringin)對照品購自中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110721-200613、110722- 200610;川陳皮素 (nobiletin)和橘皮素(tangeretin)對照品購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號分別為071209和071126，上述2種對照品的純度均大于98%。

1.3 試劑 乙腈、甲醇為色譜純，水為純凈水(娃哈哈)，其余試劑均為分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 HPLC色譜條件 Waters xbridge C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈-0.5%醋酸水，梯度洗脫 (0～20 min，10% ～25%乙腈;20～35 min，25% ～70% 乙腈;35～ 38 min，70%～95%乙腈);體積流量1 mL/min;柱溫30℃;檢測波長283 nm;進樣量10 μL。在該條件下，對照品、青皮藥材、陳皮藥材色譜圖見圖1。

2.2 供試品溶液的制備 取陳皮藥材粉末 (過60目篩)0.5 g，精密稱定。精密加入50 mL甲醇，精密稱定，超聲提取30 min，稱定補足質量，搖勻。溶液經微孔濾膜濾過，即得。

圖1 對照品 (A)、青皮 (B)、陳皮 (C)藥材HPLC分析色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，Citri reticulatae Pericarpium Viride(B)and Citri reticulatae Pericarpium(C)

2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取橙皮苷8.65 mg、柚皮苷7.30 mg、川陳皮素3.35 mg、橘皮素4.65 mg，甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得質量濃度分別為 0.865、0.73、0.335、0.465 mg/mL的混合對照品貯備液，備用。

2.4 線性關系考察 精密移取混合對照品貯備液0.1、0.4、0.6、0.8、1、2、4 mL至10 mL量瓶，甲醇定容，稀釋配制成7個質量濃度水平的對照品溶液。按“2.1”項色譜條件，對不同質量濃度的對照品溶液進行HPLC測定。分別以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行回歸計算，繪制標準曲線。柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的回歸方程分別為Y=21155046X+30186，r=0.9999;Y=19405940X+18898，r=0.9998;Y=21096914X+82019，r=0.9999;Y=24795631X+26100，r=0.9999。結果表明柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素進樣質量濃度在0.00730～0.292 mg/mL、0.00865～0.346 mg/mL、0.00335～0.134 mg/mL、0.00465～0.186 mg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 同一混合對照品溶液，按“2.1”項色譜條件連續(xù)進樣6次，結果4種黃酮的峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取新會廣陳皮藥材6份，按“2.2”項下制備供試品溶液。按“2.1”項色譜條件測定供試品中黃酮。結果橙皮苷、柚皮苷、川陳皮素、橘皮素平均含有量分別為3.16%、0.033%、0.48%、0.32%，RSD均小于3%，保留時間RSD均小于3%。表明測定方法的重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄4個黃酮的峰面積。結果橙皮苷、柚皮苷、川陳皮素和橘皮素的保留時間和峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗 稱取已知各成分含有量的新會廣陳皮 (橘皮素、川陳皮素、橙皮苷、柚皮苷分別為 3.2、4.8、31.6、0.33 mg/g)0.25 g，精密稱定。分別精密加入橘皮素、川陳皮素、橙皮苷、柚皮苷的混合對照品溶液 (質量濃度分別為0.995、1.417、1.981、0.132 mg/mL)0.6、0.8、1 mL，按“2.2”項下方法制得供試品溶液，按“2.1”項下方法進樣分析，計算加樣回收率。結果見表1。

2.9 樣品測定 廣陳皮、陳皮、廣青皮、青皮藥材，按“2.2”項下方法制備樣品溶液，按“2.1”項下方法測定峰面積，采用外標法計算藥材中4種黃酮成分的量。結果見表2。

由表2可知，各地產陳皮、青皮藥材中4種黃酮類成分均以橙皮苷含有量為最高，柚皮苷含有量最低。《中國藥典》2010年版規(guī)定陳皮中橙皮苷含有量不得少于3.5%，青皮中橙皮苷的量不得少于5%［5］。浙江和湖北產陳皮和青皮中橙皮苷的含有量均符合《中國藥典》標準，但這兩個產地青皮中多甲氧基黃酮川陳皮素和橘皮素的量要遠大于陳皮。產于廣東新會的廣陳皮是陳皮的一種，但從測定結果看，新會陳皮、青皮中橙皮苷的量均低于《中國藥典》2010年版要求，新會陳皮和青皮中川陳皮素和橘皮素的含有量相差不大。

3 討論

3.1 《本草綱目》引用朱丹溪方曰:青皮治因久積憂郁，乳房內有核如指頭，不痛不癢，五七年成癰，名乳癌。用青皮四錢，水一盞半，煎一盞，徐徐服之，日一服，或用酒服［1］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)3個不同產地的青皮中多甲氧基黃酮 (川陳皮素、橘皮素)的量均高于陳皮。其中浙江、湖北產的青皮中川陳皮素量分別是陳皮的20倍和23倍，橘皮素量是陳皮的14倍和15倍。藥理作用顯示多甲氧基黃酮抗癌活性較強［6-7］，其中川陳皮素可通過下調COX-2的表達，上調Bax的表達，顯著抑制肝癌細胞生長，減弱細胞生長因子誘導肝癌細胞的轉移［8-9］;可抑制人胃癌細胞的增殖和轉移［10-11］及p53突變的人胃癌細胞的生長［12］;體外和體內實驗均表明川陳皮素有抗肺癌細胞增殖活性［13］。橘皮素可將人乳腺癌細胞周期阻斷在G1期而顯著抑制腫瘤細胞的生長［14］，并可抑制黑色素瘤發(fā)生肺轉移［15］。本實驗研究結果對于解釋青皮可用于治療氣血瘀滯之癥瘕，而陳皮無此功效有一定啟示。

表1 加樣回收率試驗結果Tab.1 Results of recovery tests

表2 不同產地青皮、陳皮中4種黃酮的量Tab.2 Determination of flavonoids in Citri reticulatae Pericarpium and Citri reticulatae Pericarpium viride collected from different growing areas

3.2 本研究發(fā)現(xiàn)浙江、湖北產青皮、陳皮中橙皮苷的量符合《中國藥典》標準，而廣東產廣陳皮、青皮中橙皮苷量達不到《中國藥典》標準。本課題組曾收集多批新會產廣陳皮樣品，測定發(fā)現(xiàn)廣陳皮中橙皮苷的量均較低，多批次均達不到《中國藥典》標準。但來源于茶枝柑的廣陳皮中多甲氧基黃酮 (川陳皮素、橘皮素)的量要遠高于來源于橘的陳皮，分別是其11倍和8倍，此種含有量上的差異能否引起陳皮與廣陳皮功效的不同有待于進一步研究。

3.3 在流動相的選擇中，比較了甲醇-水、乙腈-水及在流動相中添加不同質量的酸對樣品分離的影響。結果顯示在流動相中添加酸，可使樣品峰形更對稱;乙腈-酸水系統(tǒng)對川陳皮素和橘皮素的分離度比甲醇－酸水系統(tǒng)好。最終確定流動相體系為乙腈-0.5%醋酸水體系，4種成分可以達到基線分離。

［1］國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會.中華本草:第4卷［M］.上海:上?？茖W技術出版社，1999:891-894.

［2］鄭國棟，蔣 林，楊得坡，等.HPLC法同時測定不同產地廣陳皮中5種活性黃酮成分［J］.中草藥，2010，41(4):652-655.

［3］Wang D，Wang J，Huang X，et al.Identification of polymethoxylated flavones from green tangerine peel(pericarpium citri reticulatae Viride)by chromatographic and spectroscopic techniques［J］.J Pharm Biomed Anal，2007，44(1):63-69.

［4］李慶耀，梁生林.陳皮的藥用研究進展［J］.中成藥，2008，30(2):246-248.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:176-177;183-184.

［6］Kandaswami C，Perkins E，Soloniuk D S，et al.Antiproliferative effects of citrus flavonoids on a human squamous cell carcinoma in vitro［J］.Cancer Lett，1991，56(2):147-152.

［7］Walle T.Methoxylated flavones，a superior cancer chemopre-ventive flavonoid subclass?［J］.Semin Cancer Biol，2007，17(5):354-362.

［8］Shi M D，Liao Y C，Shih Y W，et al.Nobiletin attenuates metastasis via both ERK and PI3K/Akt pathways in HGF-treated liver cancer HepG2 cells［J］.Phytomedicine，2013，20(8-9):743-752.

［9］Ma X，Jin S，Zhang Y，et al.Inhibitory effects of nobiletin on hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo［J］.Phytother Res，2014，28(4):560-567.

［10］Yoshimizu N，Otani Y，Saikawa Y，et al.Anti-tumour effects of nobiletin，a citrus flavonoid，on gastric cancer include:antiproliferative effects，induction of apoptosis and cell cycle deregulation［J］.Aliment Pharmacol Ther，2004，20(Suppl 1):95-101.

［11］Lee Y C，Cheng T H，Lee J S，et al.Nobiletin，a citrus flavonoid，suppresses invasion and migration involving FAK/PI3K/Akt and small GTPase signals in human gastric adenocarcinoma AGS cells［J］.Mol Cell Biochem，2011，347(1/2):103-115.

［12］Moon J Y，Cho M，Ahn K S，et al.Nobiletin induces apoptosis and potentiates the effects of the anticancer drug 5-fluorouracil in p53-mutated SNU-16 human gastric cancer cells［J］.Nutr Cancer，2013，65(2):286-295.

［13］Luo G，Guan X，Zhou L.Apoptotic effect of citrus fruit extract nobiletin on lung cancer cell line A549 in vitro and in vivo［J］.Cancer Biol Ther，2008，7(6):966-973.

［14］Morley K L，F(xiàn)erguson P J，Koropatnick J.Tangeretin and nobiletin induce G1 cell cycle arrest but not apoptosis in human breast and colon cancer cells［J］.Cancer Lett，2007，251(1):168-178.

［15］Martinez Conesa C，Vicente Ortega V，Yanez Gascon M J，et al.Treatment of metastatic melanoma B16F10 by the flavonoids tangeretin，rutin，and diosmin［J］.J Agric Food Chem，2005，53(17):6791-6797.