孫小龍，付永前，徐 晴，李 霜，黃 和

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇 南京 210009）

米根霉交替呼吸途徑高活性突變株的選育及其對富馬酸合成的影響

孫小龍，付永前，徐 晴，李 霜，黃 和

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇 南京 210009）

米根霉交替呼吸強(qiáng)度與富馬酸合成之間存在重要關(guān)聯(lián)。以米根霉F-14為出發(fā)菌株，通過常壓室溫等離子體（ARTP）離子誘變技術(shù)，篩選出1株交替呼吸強(qiáng)度增強(qiáng)的突變菌株S-1。該菌株的交替呼吸初始強(qiáng)度是出發(fā)菌株F-14的3.5倍，然而，該菌株富馬酸積累量（28g/L）卻遠(yuǎn)低于出發(fā)菌株（42g/L）。進(jìn)一步考察突變株S-1和出發(fā)株F-14菌株在發(fā)酵過程中交替呼吸及富馬酸生產(chǎn)強(qiáng)度，總呼吸變化和還原力NADH/NAD+的變化。結(jié)果表明：突變株在富馬酸發(fā)酵初始階段，過高的交替呼吸強(qiáng)度反而降低了富馬酸的生產(chǎn)速率，并導(dǎo)致了發(fā)酵后期菌體的早衰現(xiàn)象。交替呼吸強(qiáng)度與發(fā)酵進(jìn)程存在適配性，只有當(dāng)適配性達(dá)到最佳狀態(tài)時，才有利于產(chǎn)物的高效積累。

米根霉；富馬酸；交替呼吸；生產(chǎn)強(qiáng)度

富馬酸作為初級代謝產(chǎn)物，在微生物發(fā)酵過程中與能量代謝密切相關(guān)。絲狀真菌米根霉（Rhizopus oryzae）是富馬酸發(fā)酵研究的主要菌株［1］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，絲狀真菌體系中除了電子傳遞呼吸鏈外，還存在2個額外的還原型輔酶（NADH）脫氫酶和2個黃素還原酶，它們可以不經(jīng)過呼吸鏈而直接把電子傳給氧，促成胞內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）水平低，從而保證了糖酵解途徑（EMP）的暢通，這個過程稱為交替呼吸途徑［2-5］。交替呼吸起到了能量溢流的作用［2］，平衡碳代謝和電子傳遞的關(guān)系，將ATP合成與三羧酸循環(huán)（TCA）獨立開來，使得TCA繼續(xù)進(jìn)行，促進(jìn)了碳骨架的流通，有利于代謝產(chǎn)物的生成［6-7］。在真菌發(fā)酵體系中，如檸檬酸、頭孢菌素等發(fā)酵過程中，均發(fā)現(xiàn)了交替呼吸途徑與產(chǎn)物積累具有重要關(guān)聯(lián)［8-9］；王慶昭等［10］通過篩選高強(qiáng)度交替呼吸活性黑曲霉菌株（水楊氧肟酸（SHAM）敏感型菌株），獲得了高產(chǎn)檸檬酸突變株。

筆者所在課題組的Gu等［11］在米根霉的富馬酸發(fā)酵過程中也發(fā)現(xiàn)了交替呼吸途徑的存在，并對該途徑的呼吸活性與富馬酸積累的相關(guān)性以及關(guān)鍵酶——交替氧化酶及其調(diào)控方式進(jìn)行了研究。然而，交替呼吸強(qiáng)度如何影響米根霉合成富馬酸的研究鮮有文獻(xiàn)報道。筆者通過交替呼吸抑制劑水楊氧肟酸（SHAM）篩選高交替呼吸強(qiáng)度的突變株，并考察其對富馬酸合成的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株

出發(fā)菌株米根霉Rhizopus oryzae F-14為保藏于筆者所在實驗室的富馬酸高產(chǎn)菌株。

1.2 培養(yǎng)基

菌種保藏培養(yǎng)基（培養(yǎng)基A）為PDA斜面培養(yǎng)基（1 L）：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g；

篩選培養(yǎng)基（培養(yǎng)基B）：PDA培養(yǎng)基中添加SHAM 0.6g/L；

孢子萌發(fā)培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨2g、CaCl22.5g、葡萄糖60g；

發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖80g、尿素0.1g、MgSO4·7H2O 0.6g、ZnSO4·7H2O 0.018g、KH2PO40.5g、FeSO4·7H2O 0.001g、CaCO350g。

1.3 培養(yǎng)條件

米根霉于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)5～6 d，孢子成熟后，制備成孢子懸浮液（107個/mL）。取孢子懸液1mL接種至裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200r/min、35℃培養(yǎng)12 h后，按10%接種量（體積分?jǐn)?shù)），接入發(fā)酵培養(yǎng)基（250mL三角瓶裝50mL）產(chǎn)酸，200r/min、35℃培養(yǎng)12 h。

1.4 葡萄糖、富馬酸和呼吸強(qiáng)度測定

葡萄糖和富馬酸的測定參照文獻(xiàn)［12］；呼吸強(qiáng)度分析采用液相氧電極法［13］。

1.5 米根霉胞內(nèi)NADH和NAD+測定

NADH和氧化型輔酶（NAD+）的測定方法參照文獻(xiàn)［14］。

2 結(jié)果與討論

2.1 米根霉交替呼吸突變株的選育

2.1.1 SHAM濃度的確定

將原始菌株孢子液涂布在添加不同濃度SHAM的PDA培養(yǎng)基上觀察其萌發(fā)情況，結(jié)果如表1所示。由表1可知：隨著SHAM濃度的增加，米根霉孢子萌發(fā)數(shù)量顯著減少，菌絲形態(tài)由粗壯發(fā)達(dá)變?yōu)槔w細(xì)短小。當(dāng)SHAM質(zhì)量濃度為0.8g/L時，孢子萌發(fā)數(shù)目明顯減少，說明此時藥物濃度已經(jīng)對菌株生長造成明顯的影響，而0.6g/L之前的藥物濃度對菌株生長及萌發(fā)未造成顯著影響。因此，選取0.6g/L的SHAM作為篩選劑量，交替呼吸增強(qiáng)菌株在此濃度下不萌發(fā)，而原始菌株可以正常萌發(fā)。

表1 SHAM濃度對米根霉孢子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of SHAM titers on spore germination

2.1.2 交替呼吸增強(qiáng)菌株的選育

取新鮮米根霉菌株F-14斜面，適量生理鹽水洗下孢子并調(diào)整成密度約105個/mL孢子液，取10 μL孢子液涂布于直徑8 mm小鐵片上，無菌條件下自然晾干。常壓室溫等離子體（ARTP）離子機(jī)室溫誘變，氣流量（QHe）=10.0 L/min，照射距離2 mm，電功率100 W，以時間控制輻射劑量。無菌水洗滌照射以后的鐵片，并稀釋至合適濃度，取200 μL稀釋液涂布于培養(yǎng)基B，35℃恒溫培養(yǎng)12 h，用打孔器將已萌發(fā)菌落挑走舍棄，平板繼續(xù)放置35℃恒溫箱培養(yǎng)至18 h，挑出生長延遲的菌落，即為疑似交替呼吸突變株初篩菌，將其移至培養(yǎng)基A，35℃恒溫培養(yǎng)至孢子成熟，準(zhǔn)備進(jìn)一步驗證。

從篩選平板上初篩出60株菌株，收集孢子，調(diào)整至密度約107個/mL的孢子懸液，取1mL孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基內(nèi)，35℃、200r/min搖瓶培養(yǎng)12 h后，取樣測定菌體的基礎(chǔ)交替呼吸強(qiáng)度，從中篩選出10株交替呼吸強(qiáng)度相對較高的菌株，進(jìn)一步開展富馬酸發(fā)酵，結(jié)果見表2。由表2可知：10株SHAM敏感型菌株的基礎(chǔ)交替呼吸強(qiáng)度比出發(fā)株提升1倍以上，達(dá)到了總呼吸強(qiáng)度的32%～52%；而富馬酸的產(chǎn)量反而有所下降，并未達(dá)到通過增加交替呼吸強(qiáng)度來提高富馬酸產(chǎn)量的預(yù)想。菌株S-1的基礎(chǔ)交替呼吸強(qiáng)度達(dá)到了總呼吸的52%，是出發(fā)菌株的3.5倍，而富馬酸產(chǎn)量卻下降了36%。

表2 誘變菌株初始交替呼吸強(qiáng)度和富馬酸產(chǎn)量Table 2 The alternative respiration ratio and fumaric acid production of mutants

2.2 突變株S-1與原始菌株F-14的富馬酸發(fā)酵進(jìn)程

考察米根霉交替呼吸突變株S-1與原始菌株F-14的富馬酸合成過程中糖耗和富馬酸生成情況，結(jié)果見圖1。由圖1可知：在發(fā)酵前期，S-1糖耗與F-14相比相對較快；當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入到24 h以后，糖耗開始減慢，并逐漸低于F-14；發(fā)酵結(jié)束后，S-1富馬酸的產(chǎn)量為28g/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于F-14富馬酸的產(chǎn)量（42g/L），發(fā)酵液中殘?zhí)歉哌_(dá)18g/L。

圖1 S-1與F-14的糖耗與產(chǎn)酸曲線Fig.1 Glucose consumption and fumaric acid production of S-1 and F-14

2.3 交替呼吸強(qiáng)度與富馬酸生產(chǎn)強(qiáng)度的關(guān)聯(lián)性

考察菌株S-1和F-14發(fā)酵過程中的交替呼吸強(qiáng)度與富馬酸生產(chǎn)強(qiáng)度之間的關(guān)系，結(jié)果見圖2。由圖2可知：在產(chǎn)酸發(fā)酵前期（0～24 h），交替呼吸強(qiáng)度與富馬酸生產(chǎn)速率在表觀上具有一致性，當(dāng)交替呼吸強(qiáng)度達(dá)到最大時（發(fā)酵24 h），生產(chǎn)速率也達(dá)到最大值，這與Xu等［12］之前得到的結(jié)論基本吻合。S-1菌株在發(fā)酵前期的交替呼吸強(qiáng)度明顯高于原始菌，這也驗證了在發(fā)酵前期突變株S-1糖耗快于出發(fā)株F-14（圖1），但S-1菌株的富馬酸生產(chǎn)強(qiáng)度卻低于F-14；發(fā)酵中后期（24～60 h），S-1的交替呼吸強(qiáng)度迅速下降，下降幅度大于F-14，在發(fā)酵28 h左右，F(xiàn)-14的交替呼吸強(qiáng)度開始大于S-1，此時F-14富馬酸生產(chǎn)強(qiáng)度始終高于S-1。突變株S-1在發(fā)酵初期通過較強(qiáng)的交替呼吸作用雖然能提高糖耗速率，但并不利于富馬酸的高效積累，其原因可能與發(fā)酵早期細(xì)胞的能量儲備及代謝調(diào)控有關(guān)；突變株在發(fā)酵中后期交替呼吸強(qiáng)度迅速下降來調(diào)節(jié)能量平衡，從而影響后期的糖耗及產(chǎn)物合成?？梢?，交替呼吸的調(diào)節(jié)對富馬酸合成有影響，集中在發(fā)酵中后期進(jìn)行調(diào)節(jié)，將更有利于富馬酸的生成。

圖2 交替呼吸及富馬酸生產(chǎn)強(qiáng)度的關(guān)系Fig.2 Time courses of alternative respiration ratio and fumaric acid productivity of S-1 and F-14

2.4 菌株S-1與F-14總呼吸強(qiáng)度的比較

考察S-1和F-14這2株菌株總呼吸強(qiáng)度的變化情況，結(jié)果見圖3。由圖3可知：S-1的總呼吸強(qiáng)度隨著發(fā)酵的進(jìn)行而下降，當(dāng)進(jìn)入到中后期，開始迅速下降；雖然F-14也呈現(xiàn)下降的趨勢，但是下降幅度明顯小于S-1。分析原因認(rèn)為，米根霉在發(fā)酵初期，標(biāo)準(zhǔn)呼吸將提供充足的能量以供應(yīng)菌體生長以及酶系的調(diào)節(jié)，如果發(fā)酵前期供氧不足，在發(fā)酵后期，菌體代謝體系將調(diào)整交替呼吸與標(biāo)準(zhǔn)呼吸平衡，從而導(dǎo)致交替呼吸迅速下降，這也可能是糖耗以及富馬酸生產(chǎn)強(qiáng)度明顯慢于F-14的原因。通過比較2株菌的總呼吸情況進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，S-1發(fā)酵過程中存在提前衰老現(xiàn)象，因而科學(xué)并合理地調(diào)節(jié)胞內(nèi)能量代謝來提高菌體的產(chǎn)物積累速率就顯得尤為重要。

2.5 胞內(nèi)還原力的比較

通過胞內(nèi)還原型輔酶（NADH）和氧化型輔酶（NAD+）的摩爾比值來進(jìn)一步考察S-1和F-14發(fā)酵過程中胞內(nèi)還原力的變化，結(jié)果見圖4。由圖4可知：同交替呼吸變化趨勢一樣，發(fā)酵前期，S-1和F-14胞內(nèi)還原力逐漸上升，S-1的n（NADH）/ n（NAD+）高于F-14，而此時S-1菌株的糖耗速率也大于F-14，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，S-1和F-14的胞內(nèi)還原力逐漸下降，而S-1的胞內(nèi)還原力開始低于F-14，而此時S-1菌株的糖耗速率也小于F-14。整個過程中存在著相似的規(guī)律，胞內(nèi)還原力越高，糖耗越快。這可能是跟富馬酸發(fā)酵過程的碳代謝和能量供應(yīng)有關(guān)。Lambers［2］研究發(fā)現(xiàn)，交替呼吸鏈每傳遞2個電子只產(chǎn)生1分子ATP；而經(jīng)典呼吸每傳遞2個電子可產(chǎn)生2.5分子ATP；當(dāng)經(jīng)典呼吸強(qiáng)度較大時，胞內(nèi)ATP含量增多，ATP會對EMP途徑中的關(guān)鍵酶——磷酸果糖激酶起到抑制作用，從而抑制EMP途徑，并最終降低還原力 n（NADH）/ n（NAD+），反之，當(dāng)交替呼吸強(qiáng)度較大時，電子通過交替呼吸鏈時產(chǎn)生較少的ATP，從而保證了EMP的暢通，所以胞內(nèi)還原力n（NADH）/n（NAD+）的值較大，糖耗較快。

圖3 菌株S-1與F-14總呼吸曲線Fig.3 Time courses of the total respiratory rate of S-1 and F-14

圖4 菌株S-1與F-14 NADH/NAD+曲線Fig.4 Time courses of NADH/NAD+ratio of S-1 and F-14

3 結(jié)論

通過SHAM敏感型突變株的篩選，獲得了1株基礎(chǔ)交替呼吸強(qiáng)度大幅增加的米根霉突變菌株S-1，該菌株的基礎(chǔ)交替呼吸強(qiáng)度是出發(fā)菌株F-14的3.5倍；然而，該菌株富馬酸積累量（28g/L）卻遠(yuǎn)低于出發(fā)菌株（42g/L）。突變株在富馬酸發(fā)酵初始階段過高的交替呼吸強(qiáng)度反而降低了富馬酸的生產(chǎn)速率，并導(dǎo)致了發(fā)酵后期菌體的早衰現(xiàn)象。因此，針對富馬酸發(fā)酵過程需調(diào)節(jié)菌株在不同階段的交替呼吸強(qiáng)度，而非僅僅增加基礎(chǔ)交替呼吸強(qiáng)度。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Screening of Rhizopus oryzae mutants with higher activity of alternative respiration for fumaric acid production

SUN Xiaolong，F(xiàn)U Yongqian，XU Qing，LI Shuang，HUANG He
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 210009，China）

During fumaric acid fermentation，alternative respiration is associated with fumaric acid productivity in Rhizopus oryzae.S-1 mutant with higher activity of alternative respiration was screened by atmospheric and room temperature plasma（ARTP）ion mutagenesis using Rhizopus oryzae F-14 as the original strain.The activity of alternative respiration in S-1mutant is 3.5-fold than that of F-14.However，fumaric acid production（28g/L）was much lower than that of the original strain（42g/L）.The relationship between alternative respiration ratio and fumaric acid productivity，the change of total respiration activity and NADH/NAD+of S-1 and F-14 in the fermentation process were further studied.At the initial fermentation stage higher activity of alternative respiration in S-1 mutant reduced the fumaric acid productivity，and ultimately led to the premature aging phenomenon in the fermentation.It means that the activity of alternative respiration should adapt the fumaric acid productivity.

Rhizopus oryzae；fumaric acid；alternative respiration；productivity

TK6；Q819；S216·2

A

1672-3678（2015）03-0026-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.03.005

2014-03-27

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2013CB733605）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）重點項目（2011AA02A206）；國家自然科學(xué)基金（21076104、21106065、21106091）

孫小龍（1989—），女，江蘇鹽城人，碩士研究生，研究方向：生物基化學(xué)品的制備；黃 和（聯(lián)系人），教授，E-mail：biotech@ njtech.edu.cn