潘 婧 周云輝 李 梅 李保同 邱星輝**

(1．中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所農(nóng)業(yè)蟲(chóng)害鼠害綜合治理研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京100049；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，南昌 330045)

家蠅Muscadomestica是一種重要的衛(wèi)生害蟲(chóng)，可以傳播100多種人和動(dòng)物疾病(Greenber, 1965)。 家蠅的騷擾還可以降低禽類(lèi)的產(chǎn)蛋量和家畜的飼料轉(zhuǎn)化率 (Scottetal., 2009)。控制家蠅主要依賴(lài)化學(xué)殺蟲(chóng)劑，各種類(lèi)型的殺蟲(chóng)劑如傳統(tǒng)的有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲(chóng)菊酯以及相對(duì)新的吡蟲(chóng)啉等都被用于家蠅的化學(xué)防治。擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑因其具有低毒和高效等特點(diǎn)，被廣泛使用，由此帶來(lái)了家蠅對(duì)其抗性的產(chǎn)生和擴(kuò)散，家蠅抗藥性的事例有很多的報(bào)道 (Wangetal., 2012; Gaoetal., 2012; Scottetal., 2013)。

家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯的抗性已知主要有兩類(lèi)機(jī)制，即靶標(biāo)(鈉離子通道)不敏感性和細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的代謝解毒作用增強(qiáng)的代謝抗性(Scottetal., 2004)。至今已鑒定出3種鈉離子通道抗性等位基因，包括kdr(1014F， F) (Williamsonetal., 1996),kdr-his(1014H, H) (Liuetal., 2002) andsuper-kdr(918T + 1014F) (Williamsonetal., 1996, Qiuetal., 2007; Rinkevichetal., 2007)。也發(fā)現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞色素P450的過(guò)量表達(dá)與家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑抗性相關(guān)聯(lián) (Scottetal., 2004; Gaoetal., 2012)，比如在美國(guó)的LPR和中國(guó)及美國(guó)的田間抗性家蠅種群存在CYP6D1v1 抗性基因 (Kasaietal., 2000; Seifertetal., 2002；Rinkevichetal., 2006; Gaoetal., 2012)。

通常認(rèn)為，抗藥性是適應(yīng)殺蟲(chóng)劑選擇的一種進(jìn)化現(xiàn)象，在無(wú)該殺蟲(chóng)劑的環(huán)境下抗藥性昆蟲(chóng)種群通常具有一定的適合度代價(jià)(Kliotetal., 2012)。盡管這一假設(shè)得到了不少事例的支持，但也有研究表明抗性昆蟲(chóng)并不表現(xiàn)適合度不利 ( McCartetal., 2005; Crowderetal., 2009; Basitetal., 2012)。這些前期的研究表明，與抗性相關(guān)聯(lián)的適合度可能因抗性機(jī)制或抗性種群的不同而不同。有關(guān)家蠅鈉離子通道突變以及CYP6D1v1 相關(guān)的抗藥性是否存在適合度代價(jià)還不清楚。本研究以從北京采集的家蠅為研究系統(tǒng)，通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室不接觸殺蟲(chóng)劑的條件下，連續(xù)飼養(yǎng)和監(jiān)測(cè)其抗性等位基因頻率的變化，依此推測(cè)抗性等位基因是否存在適合度代價(jià)。

1 材料與方法

1.1 家蠅種群

在2010年10月，于北京奧林匹克公園的垃圾筒用網(wǎng)捕的方法采集100多頭家蠅(親代)，帶回實(shí)驗(yàn)室建立種群(取名為BJ2010)，并以500～1 000頭的種群規(guī)模連續(xù)傳代。將每代產(chǎn)卵后的成蟲(chóng)置于100% 乙醇中，保存在 -20℃ 用于個(gè)體基因型分析。對(duì)BJ2010品系家蠅的毒力測(cè)定結(jié)果顯示，相對(duì)于實(shí)驗(yàn)室敏感品系，BJ2010對(duì)氯菊酯和溴氰菊酯的抗性倍數(shù)分別為25和167倍。

1.2 鈉離子通道基因和CYP6D1基因的基因分型

在保存的親代(P)、子1代(F1)、子6代(F6)、子10代(F10)、子15代(F15)、子20代(F20)、子25代(F25)成蟲(chóng)樣品中，分別隨機(jī)抽取30頭以上個(gè)體的頭胸部，單頭提取其基因組DNA(Rinkevichetal.，2006)。 CYP6D1的基因型采用PCR-RFLP 的方法(Rinkevichetal.，2006)確定。 鈉離子通道基因型親代樣品采用測(cè)序的方法(Rinkevichetal.,2006)，其他代樣品采用PCR-RFLP 方法確定(Qiuetal., 2012 )。

2 結(jié)果

2.1 BJ2010親代樣品擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑抗性等位基因種類(lèi)與頻率

對(duì)田間采集的家蠅樣品中，檢測(cè)到了細(xì)胞色素 P450 CYP6D1基因的抗性和敏感等位基因。 抗性等位基因(CYP6D1v1, R)的5’側(cè)區(qū)包含15 bp的插入片段，其頻率為0.06 (圖1), 不包含該特征15 bp的插入片段的CYP6D1基因?yàn)槊舾械任换?S)，頻率高達(dá)0.94。 三種可能的基因型(SS, SR, RR)在樣品中均存在，敏感純合、雜合子和抗性純合子的頻率分別是0.91、 0.07 和0.02(圖2)。

圖1 家蠅種群CYP6D1等位基因頻率變化Fig.1 Changes in the frequencies of CYP6D1 alleles over 25 generations under laboratory conditions

圖2 家蠅種群CYP6D1基因型頻率變化Fig.2 Changes in the frequencies of CYP6D1 genotypes over 25 generations under laboratory conditions

從樣品中鑒定了3個(gè)鈉離子通道等位基因，包括2個(gè)抗性等位基因kdr和kdr-his和1個(gè)敏感等位基因(1014L，L)，未檢測(cè)到文獻(xiàn)報(bào)道的super-kdr，其中，敏感等位基因頻率最高(0.81)，kdr抗性等位基因頻率最低(0.07) (圖3)。 同樣，所有的6種基因型個(gè)體(LL, FF, HH, FL, HL, HF)在種群中都存在(圖4)，其中最常見(jiàn)的基因型是敏感純合子(0.69), 其次是HL 雜合子(0.17) 和FL 雜合子(0.06)， 另外三種基因型(HH, FF, HF) 的家蠅個(gè)體很罕見(jiàn)(頻率在0.02～0.03之間)。

2.2 無(wú)殺蟲(chóng)劑選擇下的家蠅種群對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑抗性等位基因頻率的變化

在無(wú)殺蟲(chóng)劑條件下，25代內(nèi)的觀察，CYP6D1 抗性等位基因頻率在0.02 至 0.13之間變動(dòng), 敏感等位基因頻率變化于0.87 和 0.97 之間(圖1)，CYP6D1不同基因型個(gè)體頻率的變化也不顯著，敏感純合個(gè)體、雜合個(gè)體以及抗性純合個(gè)體的變化范圍分別是0.80～0.96、 0.04～0.17 和 0～0.05 (圖2)。

在實(shí)驗(yàn)室正常繁殖25代內(nèi)，家蠅種群鈉離子通道基因的敏感等位基因1014L 頻率在各代中保持最高，1014H 等位基因則在0.09 和0.26之間波動(dòng), 而1014F 在波動(dòng)中從起始的0.07 降到0.01(圖3)。 總體上看，敏感純合個(gè)體 (LL) 保持著高頻率 (0.56～0.82), HL 雜合基因型個(gè)體頻率在0.17 與 0.37之間，但抗性基因型 (FF純合, FH 雜合和HH純合) 個(gè)體頻率一直處于低水平 (低于0.1), FF純合、FH 雜合和HH純合個(gè)體分別自F1、 F15 和 F20代之后檢測(cè)不到(圖4)。

圖3 家蠅種群鈉離子通道等位基因頻率變化Fig.3 Changes in the frequencies of Vssc alleles over 25 generations under laboratory conditions

圖4 家蠅種群鈉離子通道基因型頻率變化Fig.4 Changes in the frequencies of six Vssc genotypes over 25 generations under laboratory conditions

3 討論

家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯的抗藥性受多基因的控制，可以通過(guò)基因的位點(diǎn)突變(如鈉離子通道基因Vssc)，或更復(fù)雜的分子事情如基因的表達(dá)調(diào)控 (如CYP6D1) 來(lái)實(shí)現(xiàn)。 擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑用于公共衛(wèi)生領(lǐng)域始于上世紀(jì)70年代末，至今有30多年的用藥歷史，家蠅產(chǎn)生抗藥性并不令人奇怪。通過(guò)對(duì) 98 個(gè)家蠅個(gè)體的基因型檢測(cè)， 發(fā)現(xiàn)了kdr、kdr-his和CYP6D1v1 抗性等位基因的存在。kdr-his的基因頻率(0.12) 高于kdr(0.07)，這與我們先前對(duì)中國(guó)采集的家蠅的研究結(jié)果一致(Wangetal., 2012)。值得注意的是，無(wú)論是鈉離子通道基因，還是CYP6D1基因，敏感等位基因頻率在本研究的種群中的頻率很高。如敏感的鈉離子通道基因(1014L)的頻率在0.81, 高于從美國(guó)和丹麥采集的家蠅(Rinkevichetal., 2006; Huangetal., 2004; Scottetal., 2013), 但接近土爾其家蠅種群(0.72) (Taskinetal., 2011)。北京種群CYP6D1 敏感等位基因(S)頻率高達(dá)0.94， 比報(bào)道的采自美國(guó)、土爾其等地的家蠅種群高很多(Rinkevichetal., 2006; Rinkevichetal., 2007; Taskinetal., 2011; Scottetal., 2013), 但在我國(guó)家蠅種群已報(bào)道的頻率值范圍內(nèi)(Wangetal., 2012)。BJ2010種群具有對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯的抗性，但其鈉離子通道抗性等位基因以及CYP6D1v1抗性等位基因的的頻率都很低，暗示該種群還存在其他抗性機(jī)制。

通常認(rèn)為，抗藥性是昆蟲(chóng)適應(yīng)殺蟲(chóng)劑選擇下的結(jié)果，由此推測(cè)抗性種群相對(duì)于敏感種群在沒(méi)有殺蟲(chóng)劑的環(huán)境下具有更低的適合度 (Roushetal., 1990)。 如果該推測(cè)正確，從抗性遺傳的角度則抗性等位基因頻率在無(wú)殺蟲(chóng)劑的條件下會(huì)隨時(shí)間而下降。本研究的結(jié)果顯示CYP6D1 的抗性等位基因頻率在25代傳代范圍內(nèi)變化非常之小，提示CYP6D1v1 并不表現(xiàn)出適合度代價(jià)，這一結(jié)果與美國(guó)的一個(gè)研究結(jié)果相一致(Rinkevichetal., 2013)，也部分解釋了CYP6D1v1 在全球廣泛存在的原因 (Rinkevichetal., 2006; Taskinetal., 2011; Wangetal., 2012)。與此類(lèi)似，鈉離子通道1014H(kdr-his)抗性等位基因頻率變化在25代期間的變化也很小，表明在無(wú)殺蟲(chóng)劑的實(shí)驗(yàn)室條件下，相對(duì)種群中存在的其他等位基因，鈉離子通道1014H等位基因也不存在適合度代價(jià)。

早期的一個(gè)研究表明攜帶1014F 突變的抗性家蠅與敏感家蠅相比表現(xiàn)出溫度偏好性的差異的(Fosteretal., 2003)，這種差異是否代表具有適合度代價(jià)現(xiàn)在還不清楚。 通過(guò)對(duì)種群中1014F 頻率隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，1014F 頻率有所下降(從0.07到0.01)，但由于1014F 的起始頻率非常低，其頻率的下降很有可能是遺傳漂變的結(jié)果。而不是其存在適合度劣勢(shì)，這一推論還需要進(jìn)一步的研究數(shù)據(jù)。

綜上，通過(guò)對(duì)家蠅已知的抗性等位基因頻率在種群中的頻率的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在無(wú)殺蟲(chóng)劑的條件下擬除蟲(chóng)菊酯抗性等位基因頻率并不下降，說(shuō)明攜帶抗性等位基因kdr-his或CYP6D1v1的家蠅不表現(xiàn)適合度不利。抗性等位基因頻率的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果表明，抗性基因一旦在種群被選擇出來(lái)，在無(wú)殺蟲(chóng)劑的選擇下達(dá)到平衡，很難再?gòu)娜后w中消失。這一研究結(jié)果與王學(xué)軍等(2008)根據(jù)毒力測(cè)定數(shù)據(jù)而得出的結(jié)論相一致。這也提示，換用殺蟲(chóng)劑對(duì)抗性家蠅的防治可能有效，而輪用以往常用的殺蟲(chóng)劑則存在風(fēng)險(xiǎn)。