喬中全, 王曉明, 陳建軍, 曾慧杰, 李永欣, 蔡 能

(湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長沙 410004)

適用于轉(zhuǎn)錄組測序的灰氈毛忍冬體胚總RNA提取方法篩選

喬中全, 王曉明, 陳建軍, 曾慧杰, 李永欣, 蔡 能

(湖南省林業(yè)科學(xué)院， 湖南 長沙 410004)

為了找到適用于轉(zhuǎn)錄組測序要求的灰氈毛忍冬體胚總 RNA 的提取方法，以體胚發(fā)育過程中的球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚為實驗材料，比較分析了EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒法、RNA Cleanup Kit試劑盒法及改良 CTAB 法3種方法的 RNA 提取效果。結(jié)果表明： 改良 CTAB 法提取的RNA濃度較低，提取過程中發(fā)生降解；RNA Cleanup Kit試劑盒法提取的RNA完整性較差，RIN值沒能達到轉(zhuǎn)錄組測序的要求。EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒法提取的RNA質(zhì)量最高，且完整性好，能夠滿足轉(zhuǎn)錄組測序的要求。

灰氈毛忍冬； 體胚； RNA提取； 轉(zhuǎn)錄組測序

灰氈毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.)，為忍冬科忍冬屬植物，是我國傳統(tǒng)中藥材之一，具有抗衰老、抗病毒、清熱、消炎、保肝等生物學(xué)活性作用[1-3]。已被廣泛應(yīng)用于制藥、保健品、化妝品、飲料等領(lǐng)域[4]。近年來有關(guān)灰氈毛忍冬的研究多集中在新品種選育、快繁技術(shù)、高效栽培技術(shù)等方面，關(guān)于其分子生物學(xué)方面的研究報道較少。

目前關(guān)于植物總 RNA 提取方法的報道比較多，但是不同植物或同一植物的不同組織采用的RNA提取方法未必相同，同一種方法不一定具有通用性。因此，要根據(jù)具體的植物或器組織探索適宜的RNA 提取方法[5-7]?；覛置潭w胚中含有大量的多酚和多糖等次生代謝產(chǎn)物，并且組織內(nèi)富含RNase，RNA極易被分離降解，給灰氈毛忍冬RNA的提純帶來許多困難。

目前針對適用于灰氈毛忍冬體胚發(fā)育過程不同階段轉(zhuǎn)錄組測序的 RNA 提取方法尚未見報道。基于此，本研究采用3 種方法對球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚進行總 RNA 提取，并對提取的RNA 質(zhì)量進行比較分析，為篩選出適用于轉(zhuǎn)錄組測序的灰氈毛忍冬體胚總 RNA 提取方法的建立提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗用材料為灰氈毛忍冬的不同發(fā)育階段體胚，即：球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚。取樣品后迅速裝入滅菌的RNase-free 離心管中，置于液氮中保存。

1.2 總RNA提取方法

采用三種總RNA提取方法提取灰氈毛忍冬體胚總RNA，方法1： EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒法；方法2： RNA Cleanup Kit試劑盒法；方法3：改良的CTAB法。方法3主要做以下改良： ①在加液氮研磨樣品前加入PVP。②將研磨好的樣品加入到65℃預(yù)熱好的CTAB提取液中，加2%的巰基乙醇。65 ℃水浴中溫浴30 min，在此期間用手輕輕搖晃6次。③水浴后冷卻至室溫，12 000 r/min，離心10 min。④取上清，加等體積的氯仿/異戊醇(24/1)，混勻后靜置10 min，12 000 r/min，離心10 min。⑤取上清，加1/10體積的5 mol/L的NaAc，加2/3體積的異丙醇，-20 ℃沉淀1 h。⑥4 ℃、12 000 r/min，離心10 min。⑦70%的酒精清洗2次，自然晾干，溶解。⑧加DNase水解DNA。

1.3 RNA質(zhì)量檢測

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測 RNA條帶的清晰度和完整性，采用Agilent 2100檢測28S/18S值及RNA的純度和濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA電泳結(jié)果分析

由圖1可以看出，3種方法提取的RNA都能看到28S和18S兩條帶，但是方法3提取的RNA條帶不明亮，說明該方法提取的RNA濃度較低、完整性較差。用方法2提取的RNA條帶較清晰，28S的亮度比18S高，明顯好于方法3，但有輕微的拖尾現(xiàn)象；方法1提取的RNA條帶無拖尾、彌散現(xiàn)象，28S和18S兩條帶明亮且亮度比約為2∶1，說明其完整性好。

注:由左向右依次為EASYspinPlus植物RNA快速提取試劑盒法、RNACleanupKit試劑盒法、改良CTAB法。圖1 3種不同方法提取的RNA電泳結(jié)果Fig.1 TheextractionresultsofRNAelectrophoreticof3differentmethods

2.2 RNA質(zhì)量及濃度分析

從表1可以看出，3種方法提取的 RNA OD260/OD280值為2.12～2.19、OD260/OD230值為1.96～2.26，說明采用這3種方法提取的RNA純度較好，沒有污染，都能達到后續(xù)試驗的要求。用方法3提取的球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚RNA 濃度較低，分別為335、267、282和298；RIN 值分別為 4.8、4.3、5.2和5.7，28S/18S值為1.6、1.7、1.5和1.6，說明 RNA 降解嚴(yán)重，完整性差。用方法2提取的 RNA 濃度較高，分別為423、446、459和492；28S/18S值 1.8、1.7、1.5和1.6；RIN值分別為 6.5、6.3、6.4和6.4，略低于轉(zhuǎn)錄組測序要求。方法1提取的 RNA 濃度分別為741、762、759和737；28S/18S值分別為 1.9、1.9、1.8和1.7，RIN值分別為9.8、9.8、9.5和9.5，在質(zhì)量上完全能夠達到文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序的要求。

表1 不同提取方法對灰氈毛忍冬體胚總RNA提取結(jié)果比較Tab.1 ComparisonofthetotalRNAsextractedfromdifferentsomaticembryosofLoniceramacranthoidesHand.-Mazz.withdifferentmethods提取方法體胚階段RNA濃度(ng/μL)OD260/OD280OD260/OD230RIN值28S/18S球形胚7412.182.219.81.9心形胚7622.152.269.81.9EASYspinPlus植物RNA快速提取試劑盒法魚雷胚7592.162.039.51.8子葉胚7372.152.089.31.7球形胚4232.182.026.51.8心形胚4462.182.166.31.8RNACleanupKit試劑盒法魚雷胚4592.191.966.41.7子葉胚4922.162.056.41.5球形胚3352.172.094.81.6心形胚2672.182.074.31.7改良CTAB法魚雷胚2822.192.065.21.5子葉胚2982.122.125.71.6

3 結(jié)論與討論

不管是高通量測序，還是RT — PCR等分子生物學(xué)實驗，提取得到質(zhì)量高的RNA是實驗的前提和基礎(chǔ)[8]。目前，有關(guān)植物總RNA提取方法的報道已經(jīng)很多，但不同RNA提取方法具有各自的優(yōu)缺點，不同方法適用于不同的植物，即使同一種植物的不同組織適宜的方法也不盡相同[9-12]。植物轉(zhuǎn)錄組測序?qū)颖究俁NA的質(zhì)量要求非常高，要求RNA總量≥20ng、濃度≥500ng/μL、OD260/OD280為1.8～2.2、OD260/OD230>1.9、RIN≥7、28S/18S>1.0，因此，找到一種能夠滿足轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量要求的RNA提取方法非常重要?；覛置潭w胚中含有大量的酚類和多糖物質(zhì)，酚類物質(zhì)在RNA提取過程中極易發(fā)生褐化反應(yīng)，被氧化成醌類化合物不可逆的與RNA結(jié)合，致使提取到的RNA質(zhì)量非常差，所以在實驗過程中必須要有效的去除組織中的多糖及酚類物質(zhì)，才能得到高質(zhì)量的RNA，滿足轉(zhuǎn)錄組測序的需要[13-15]。

本研究以灰氈毛忍冬體胚發(fā)育過程中的4個階段為實驗材料，采用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒法、RNA Cleanup Kit試劑盒法和改良的CTAB法分別提取球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚總RNA，并對3種提取方法的效果進行了分析。3種方法提取的 RNA 的OD260/OD280和OD260/OD230都符合要求，說明采用這3種方法提取的RNA純度較好，沒有污染。方法3提取的RNA濃度較低，提取過程中發(fā)生降解；方法2提取的RNA完整性較差，RIN值沒能達到轉(zhuǎn)錄組測序的要求。方法1提取的RNA各方面均能達到轉(zhuǎn)錄組測序的要求。

[1] 王天志, 李永梅. 金銀花的研究進展[J]. 華西藥學(xué)雜志,2000,15(4):292-298.

[2] 中國藥材公司. 中國中藥資源志要[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1994.

[3] 王曉明, 李永欣, 聶啟英. 金銀花組織培養(yǎng)的研究進展[J]. 湖南林業(yè)技,2006,33(4):1-3.

[4] 石鉞, 石任兵, 陸蘊如. 我國藥用金銀花資源、化學(xué)成分及藥理研究進展[J]. 中國藥學(xué)雜志,1999,34(11):23-35.

[5] Ainsworth C. Isolation of RNA from floral tissue of Rum exacetosa(sorrel)[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1994, 12(3):198-203.

[6] Lewin sohn E, Steele C L, Croteau R. Simple isolation of functional RNA from woody stems of gym nosperms [J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1994, 12(1): 20-25.

[7] Su X, Gibor A. A method for RNA isolation from marine microalgae[J]. Anal Biochem,1988, 174:650-657.

[8] 熊毅, 郭彥萃, 張志. 木耳總RNA提取方法研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2014, 26(2): 456-460.

[9] Chang S J, Puryear J, Cainey J. A simple and efficient method for RNA isolating from pine trees [J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1993, 11(2): 113-116.

[10] Liu Y Z, Liu Q, Tao N G, et al. Efficient Isolation of RNA from Fruit Peel and Pulp of Ripening Navel Orange (Citrus saneness Osbeck) [J]. Journal of Hua zhong Agricultural University, 2006, 25(3): 300-304.

[11] 徐昌杰, 陳昆松, 張波. 柑橘組織RNA提取方法研究[J]. 果樹學(xué)報, 2004, 21(2):136-140.

[12] 李曉穎, 曹雪, 房經(jīng)貴. 杏葉片與果實總 RNA 提取方法研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2010, 26(2):152-156.

[13] 周亞奎, 楊云, 隋春, 等. 檳榔黃化病組織RNA提取方法的比較[J]. 生物技術(shù)通報, 2010(8) : 153-156.

[14] 熊毅, 郭彥萃, 張志. 木耳總RNA提取方法研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2014, 26(2): 456-460.

[15] SU X, GIBOR A. A method for RNA isolation from marine macro-algae[J]. Analytical biochemistry, 1988, 174(3) : 650-657.

ScreeningofmethodstoextracttotalRNAfrommicro-sporeofsomaticembryosofLoniceramacranthoidesHand.-Mazzfortranscriptomesequencing

QIAO Zhongquan, CHEN Jianjun, WANG Xiaoming, ZENG Huijie, LI Yongxin, CAI Neng

(Hunan Academy of Forestry，Changsha 410004，China)

In order to find out micro-spore extracting method suitable for transcriptome sequencing，this study took somatic embryos ofLoniceramacranthoidesHand.-Mazz. as experimental material and micro-spore induced with globular embryo, heart shaped embryo, torpedo embryo and embryo as research object. This study compared and analyzed the RNA extraction effects by 3 different methods：EASYspin Plus method, RNA Cleanup Kit method, improved CTAB method. The results showed that RNA concentrations extracted by improved CTAB method were lower，and degradationappearedinextraction process. Integrity of RNA extracted by RNA Cleanup Kit method was bad，and the RIN value did not meet the requirements of transcriptome sequencing．Quality of RNA extracted by EASYspin Plus method was the highest，and the RNA integrity was also good．Therefore，RNA obtained by this method was suitable for satisfying the requirement of transcriptome sequencing．

LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.； somatic embryos； RNA extraction； transcriptome sequencing

2015-09-07

湖南省科學(xué)技術(shù)廳科技計劃重點項目：金銀花體胚發(fā)生的分子基礎(chǔ)與再生研究(2012FJ2011)。

喬中全(1985-)，男，山東省曹縣人，研究實習(xí)員，主要從事林木遺傳育種、栽培及生物技術(shù)研究。

Q 949.781.2

A

1003 — 5710(2015)06 — 0099 — 03

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2015. 06. 019

(文字編校：楊 駿)