張德輝，孫亞麗，趙 亮，丑敏霞（西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100）

天藍(lán)苜蓿鋅脅迫下實(shí)時定量PCR內(nèi)參基因篩選

張德輝，孫亞麗，趙 亮，丑敏霞*（西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100）

選取8個管家基因（h2a、act、18s、tub、ubi、ef1、cyp、gapdh）作為候選內(nèi)參基因，以不同濃度Zn2+處理下接菌第30d的天藍(lán)苜蓿（Medicago Lupulina L.）接種根為實(shí)驗(yàn)材料，篩選用于目的基因?qū)崟r熒光定量PCR分析的最佳內(nèi)參基因.研究表明：候選內(nèi)參基因平均表達(dá)穩(wěn)定性由高到低排序?yàn)椋篹f1＞ubi＞act＞h2a＞gapdh＞cyp＞18s＞tub；在不同Zn2+濃度脅迫下，最適內(nèi)參基因組合各不相同：Zn2+=100mg/kg時，最佳內(nèi)參基因組合為tub （1.97）和ef1 （2.06）； Zn2+=200mg/kg時，最佳內(nèi)參基因組合為ef1 （1.41）和ubi （2.51）； Zn2+=300mg/kg時，最佳內(nèi)參基因組合為ef1 （1.41）和h2a （2.78）； Zn2+=400mg/kg時，最佳內(nèi)參基因組合為ef1 （2.45）和act （2.55）.該研究可為重金屬污染地天藍(lán)苜?？剐曰蚝凸采虻谋磉_(dá)分析提供理論依據(jù).

天藍(lán)苜蓿；接種根；內(nèi)參基因；實(shí)時熒光定量PCR；鋅

土壤是人類賴以生存的主要資源之一，隨著工業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，土壤污染尤其是重金屬污染尤為突出［1-2］，而某些微生物、植物與微生物共生體對重金屬污染土壤的修復(fù)發(fā)揮著重要作用［3］.重金屬污染的土壤，氮素不足是限制植被恢復(fù)的關(guān)鍵因子之一，因此提高重金屬污染土壤中氮素水平成為生態(tài)修復(fù)的首要工作［4］.豆科植物---根瘤菌的共生體系因其卓越的固氮能力，常作為尾礦地環(huán)境修復(fù)的先鋒植物.

目前，許多國家都非常重視重金屬耐性豆科植物的選擇和根瘤菌的研究以及利用豆科植物根瘤菌共生體系進(jìn)行重金屬污染地修復(fù)的實(shí)踐. Piha等［5］在Sn礦尾礦地進(jìn)行植被重建的試驗(yàn)研究顯示，豆科植物具有良好的成活率和較好的生長速度；他同時指出，耐性豆科植物可以與根瘤菌共生而克服廢棄地瘦瘠所帶來的障礙.Jha等［6］利用豆科灌木修復(fù)石灰石采石場廢棄地及Smyth等［7］利用豆科植物修復(fù)煤礦廢棄地，所有這些實(shí)踐都是非常成功的.豆科植物分子水平抗性基因、共生基因的篩選及其功能研究受到廣泛關(guān)注［8-9］.利用豆科植物---根瘤菌共生固氮作用在重金屬污染的尾礦廢棄地土壤植被修復(fù)和生態(tài)重建的研究也日趨成熟，這也為污染土壤重金屬控制和修復(fù)提供了較為完整的理論和實(shí)踐基礎(chǔ).

近年來，對植物內(nèi)參基因的篩選已有眾多報(bào)道［10-12］，但對豆科植物內(nèi)參基因篩選只有花生、黑吉豆等［13-14］少數(shù)報(bào)道.大多數(shù)內(nèi)參基因篩選局限在不同時期不同組織、生物脅迫以及非生物脅迫中干旱和鹽脅迫樣本，對于豆科植物在重金屬脅迫下內(nèi)參基因的篩選鮮有報(bào)道.然而對于這方面的研究，將有助于對豆科植物抗性基因、共生基因的表達(dá)研究.

實(shí)時定量PCR（qRT-PCR）具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確、特異性等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于基因的表達(dá)分析［15］.利用qRT-PCR分析目的基因表達(dá)時，一個好的內(nèi)參基因可以消除RNA提取質(zhì)量以及反轉(zhuǎn)錄效率等所帶來的背景誤差［16-17］，因此篩選特定背景下最適內(nèi)參基因?qū)δ康幕虮磉_(dá)分析至關(guān)重要.

本研究選取選取8個管家基因作為候選內(nèi)參基因：組蛋白基因（Histone H2A，h2a）、肌動蛋白基因（Actin，act）、18S核糖體RNA基因（18S ribosomal RNA，18s）、β-微管蛋白基因（Tubulin beta chain，tub）、泛素蛋白基因（Ubiquitin，ubi）、延伸因子-1α基因（Elongation factor 1-alpha，ef1）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh）、親環(huán)蛋白基因（cyclophilin，cyp）.管家基因編碼蛋白不僅是細(xì)胞器骨架基本組分（actin、tub）、真核生物染色體基本結(jié)構(gòu)蛋白（h2a）和廣泛存在于原核和真核生物中的胞漿蛋白（cyp），還參與生物體的基本代謝過程（gapdh、ef1、ubi），因此，理論上管家基因在生物體內(nèi)都是穩(wěn)定表達(dá)的.此外，18S核糖體RNA調(diào)控合成獨(dú)立于信使RNA，因此核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)較為穩(wěn)定，常被用作內(nèi)參基因來校正目的基因的表達(dá).

本實(shí)驗(yàn)對不同Zn2+濃度處理下天藍(lán)苜蓿接種根實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析篩選最適內(nèi)參基因組合，為重金屬污染土壤修復(fù)過程中抗性基因、共生基因的表達(dá)分析提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

供試天藍(lán)苜蓿（Medicago Lupulina L.）種子和苜蓿中華根瘤菌CCNWSX0020（Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020）（該菌具有良好的鋅抗性）均由本實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 方法

1.2.1 天藍(lán)苜蓿種植及樣品采集 天藍(lán)苜蓿種子脫皮，無菌水沖洗6～8次，95%（V/V）酒精浸泡1min，30%（V/V））NaClO處理2min，最后用無菌水沖洗6～8次用于播種.播種前，每個花盆裝入200g基質(zhì)（蛭石與珍珠巖按體積比為2：1形式充分混勻），121℃滅菌1h；實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的硫酸鋅（Zn2+濃度：100， 200， 300， 400mg/kg）模擬鋅污染.光照培養(yǎng)：將花盆置于智能植物培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱參數(shù)為：16h光照/8h黑暗，溫度為（24±2）℃，濕度為40%，光照強(qiáng)度為4級.當(dāng)幼苗長出第一片真葉，接種根瘤菌CCNWSX0020，期間無氮營養(yǎng)液［18］和無菌水交替澆水，取接菌后30d天藍(lán)苜蓿共生根于液氮迅速冷凍后置于-80℃保存用于RNA提?。拷M樣品重復(fù)3次）.

1.2.2 總RNA提取與cDNA合成 利用RNAiso Plus試劑盒（TaRaKa公司）提取RNA，提取流程按照說明書進(jìn)行.對所提取的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測（OD260/280= 1.8～2.0， OD260/230＞2.0）.利用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaRaKa公司）將提取的RNA（0.5μg）按照說明書合成cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及其特異性檢測 本研究選取8個功能不同的管家基因：h2a、act、18s、tub、ubi、ef1、gapdh、cyp作為候選內(nèi)參基因.利用Primer5.0軟件參考蒺藜苜蓿相關(guān)基因cDNA序列設(shè)計(jì)引物.引物特異性檢測：不同濃度Zn處理樣品cDNA等量混合，普通PCR擴(kuò)增候選內(nèi)參基因瓊脂糖凝膠電泳檢測并送上海英濰捷基公司測序.qRT-PCR分析溶解曲線.

1.2.4 熒光定量PCR分析及擴(kuò)增效率檢測 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA稀釋10倍，使用SYBR?Primix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa公司）用于qRT-PCR反應(yīng).各內(nèi)參基因的熒光定量反應(yīng)在CFX 96TMRealTime System（Bio-Rad）熒光定量儀上進(jìn)行.反應(yīng)體系為20μL，其中SYBR?Primix Ex TaqTM（2×）10μL，ddH2O 5.4μL，cDNA模板3μL，上、下游引物（10mmol/L）各0.8μL.反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2min；95℃變性5s；60℃退火30s；72℃延伸30s；39個循環(huán).

引物擴(kuò)增效率檢測：所有樣品cDNA等量混合用于PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋104后，依次稀釋5， 52， 53， 54， 55倍用于qRT-PCR擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算引物擴(kuò)增效率.

1.2.5 Cycle threshold（Ct）值比較 對各候選內(nèi)參基因在所有樣品中Ct值比較分析，通過SigmaPlot 10.0軟件作圖，得出各候選內(nèi)參基因在樣品中Ct值分布范圍，反映各候選內(nèi)參基因在綜合脅迫下平均表達(dá)水平.比較同一候選內(nèi)參基因在不同Zn2+濃度處理樣品中Ct值變化，反映各候選內(nèi)參基因在不同樣品中的相對表達(dá)量.

1.2.6 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析 通過在線評估內(nèi)參基因穩(wěn)定性工具（http：//www.leonxie. com/referencegene.php）分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性［19］.該在線工具集合了the comparativeΔCt method［20］， BestKeeper［21］， NormFinder［22］和geNorm［23］4個穩(wěn)定性評估軟件；此外，該在線工具對以上4個軟件計(jì)算結(jié)果進(jìn)行綜合分析，得到各候選內(nèi)參基因綜合排名.

1.2.7 評價候選內(nèi)參基因最適數(shù)目 候選內(nèi)參基因最適數(shù)目通過geNorm軟件計(jì)算基因的配對變異值Vn/n+1確定內(nèi)參基因的最適數(shù)目.利用geNorm軟件計(jì)算n個基因作為內(nèi)參基因得出的標(biāo)準(zhǔn)化因子與n+1個基因作為內(nèi)參基因得出的標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對變異值Vn/n+1.一般認(rèn)為當(dāng)Vn/n+1＜0.15時，表明研究目的基因表達(dá)過程中使用n個內(nèi)參基因可以得到準(zhǔn)確結(jié)果，沒有必要引入第n+1個內(nèi)參基因.

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性及擴(kuò)增效率檢測

凝膠電泳檢測普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示：只有特異性擴(kuò)增條帶，無其它雜帶，且片段大小與目的條帶一致（測序結(jié)果與目的基因序列一致）. qRT-PCR溶解曲線顯示：只有單一主峰，沒有其它雜峰出現(xiàn)，說明所設(shè)計(jì)引物特異性良好.引物擴(kuò)增效率均在85%～100%.所設(shè)計(jì)引物符合實(shí)驗(yàn)要求（表1）.

表1 候選內(nèi)參基因引物Table 1 Primers used to amplify candidate reference genes

2.2 候選內(nèi)參基因在樣品中的平均表達(dá)水平

圖1 候選內(nèi)參基因平均表達(dá)水平Fig.1 Average expression levels of candidate reference genes

利用比較Ct值的方法評估各候選內(nèi)參基因在所有樣品綜合脅迫下平均表達(dá)水平（圖1）.由圖1可知，綜合脅迫下：18s的Ct值最小，平均表達(dá)水平最高，cyp的Ct值最大，平均表達(dá)水平最低；其它各候選內(nèi)參基因平均表達(dá)水平相差不大，Ct值集中在22～28.

2.3 候選內(nèi)參基因在不同樣品中相對表達(dá)量

由圖2可知，同一候選內(nèi)參基因在不同Zn2+濃度處理下其表達(dá)水平各異，但隨著Zn2+濃度的升高，Ct值總體呈現(xiàn)上升趨勢，候選內(nèi)參基因表達(dá)呈下降趨勢.

圖2 候選內(nèi)參基因不同樣品中相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression of candidate reference genes in different samples

2.4 所有樣品中候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

表2 所有樣品中候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 2 Expression stability of candidate reference genes in all samples

利用在線評估工具分析所有樣品中候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性（表2）.由表2可知：18s和tub是最不穩(wěn)定內(nèi)參基因； the comparative ΔCt method，BestKeeper， NormFinder分析表明ef1是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因， h2a、ubi、act是穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因. geNorm分析表明act、ubi是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因， ef1、h2a是穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因.通過對上述四個軟件結(jié)果的綜合分析進(jìn)行綜合排名（穩(wěn)定性由高到低）：ef1＞ubi＞act＞h2a＞gapdh＞cyp＞18s＞tub.

2.5 候選內(nèi)參基因在不同Zn2+濃度脅迫下穩(wěn)定性分析

在線評估不同Zn2+濃度脅迫下候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性，得到候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性綜合排名（表3）. Zn2+＜100mg/kg時， tub為最穩(wěn)定內(nèi)參基因，ef1是較好內(nèi)參基因； Zn2+＞200mg/kg時， ef1為最佳內(nèi)參基因， 18s、tub為最不穩(wěn)定內(nèi)參基因.

對不同Zn2+濃度處理下內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析表明：在低濃度（＜100mg/kg）處理下，tub （1.97）為最佳內(nèi)參基因而中高濃度（＞200mg/kg）脅迫下，tub穩(wěn)定性隨Zn2+濃度的升高變化較大（表3）.據(jù)相關(guān)報(bào)道表明Tubulin蛋白與鈣離子密切相關(guān)［24］，在天藍(lán)苜蓿與根瘤菌共生結(jié)瘤過程中，伴隨鈣流、鈣峰的形成［25-26］，隨著Zn濃度的升高，結(jié)瘤數(shù)目越來越少，當(dāng)Zn濃度達(dá)到400mg/kg時，結(jié)瘤數(shù)幾乎為0，這與tub隨Zn濃度升高越來越不穩(wěn)定一致.因此當(dāng)Zn濃度不足以對天藍(lán)苜蓿共生互作造成明顯影響時可以使用tub作為內(nèi)參基因，但在中高濃度下研究基因表達(dá)時應(yīng)避免使用tub作為內(nèi)參基因.同時進(jìn)一步說明篩選最佳內(nèi)參基因的必要性.

表3 候選內(nèi)參基因在不同鋅濃度脅迫樣品中穩(wěn)定性Table 3 Stability of candidate reference genes in different zinc stress concentration

2.6 最適內(nèi)參基因數(shù)目判定

越來越多的實(shí)驗(yàn)表明，使用2個或2個以上內(nèi)參基因校正目的基因表達(dá)可以保證結(jié)果準(zhǔn)確性［27］.利用geNorm軟件判定本研究最適內(nèi)參基因數(shù)目，對所有樣品或某一Zn2+濃度處理樣品分析，V2/3均小于0.15（圖3）.分析表明研究天藍(lán)苜蓿接種根Zn脅迫下基因表達(dá)分析時，選取兩個內(nèi)參基因足以得到準(zhǔn)確結(jié)果.

目前，對內(nèi)參基因篩選大多使用geNorm單一軟件或兩個軟件結(jié)合［28-30］，這就不可避免帶來分析誤差.本研究使用在線評估內(nèi)參基因穩(wěn)定性工具，該工具不僅包含了ΔCt method、BestKeeper、NormFinder、geNorm分析軟件而且綜合4個軟件分析結(jié)果給出綜合排名，避免了單一軟件分析帶來的誤差.

圖3 geNorm軟件評估最適內(nèi)參基因數(shù)目Fig.3 Evaluation of optimal number of reference genes for normalization by geNorm

3 結(jié)語

本研究通過the comparative ΔCt method、BestKeeper、NormFinder、geNorm分析軟件以及依據(jù)上述4個軟件得出的結(jié)果綜合分析，對8個候選內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性排名.結(jié)果表明天藍(lán)苜蓿接種根在低濃度Zn2+處理下tub是最穩(wěn)定內(nèi)參基因，中高濃度脅迫下ef1是最佳內(nèi)參基因，最后根據(jù)不同Zn2+濃度處理選擇最適的內(nèi)參基因組合.這為研究重金屬Zn污染土壤基因的表達(dá)研究提供參考.

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Reference gene selection for quantitative real-time PCR normalization in Medicago Lupulina under zinc stress.

ZHANG De-hui， SUN Ya-li， ZHAO-Liang， CHOU-Min-xia*（College of Life Sciences， State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas， Northwest Agriculture and Forestry University， Yangling 712100， China）. China Environmental Science， 2015，35（3）：833～838

Expression stability of candidate reference genes （h2a、act、18s、tub、ubi、ef1、cyp、gapdh） was tested for qRT-PCR during growth conditions under the different zinc stress. The roots of Medicago lupulina inoculated with rhizobia were harvested in 30days as plant materials. Our results showed that the average expression stability of the eight candidate reference genes from high to low was ef1＞ubi＞act＞h2a＞gapdh＞cyp＞18s＞tub overall. Specifically， tub （1.97）and ef1 （2.06） were better reference genes under the low Zn2+concentration （100mg/kg）； The genes ef1 （1.41） and ubi（2.51） were the best genes under Zn2+concentration （200mg/kg）； Under Zn2+concentration （300mg/kg）， ef1 （1.41） and h2a （2.78） were the most comparatively suitable genes； while ef1 （2.45） and act （2.55） were considered as the most reliable reference genes under the high Zn2+concentration （400mg/kg）. In conclusion， All results provide the theoretical foundation for gene expression study in Medicago lupulina under the different Zn2+concentration.

Medicago Lupulina；the inoculated roots；reference gene；quantitative real-time PCR；Zn

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1000-6923（2015）03-0833-06

張德輝（1989-），男，山東武城縣人，西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士研究生，主要從事微生物資源與利用的研究.

2014-06-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31172252）

* 責(zé)任作者， 副教授， minxia95@126.com