黃瑩瑩，白 羽，王 艷，2*，孔海南（.上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240；2.上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200025）

基于iTraq技術(shù)的加拿大一枝黃花提取物作用下銅綠微囊藻細(xì)胞差異表達蛋白

黃瑩瑩1，白 羽1，王 艷1，2*，孔海南1（1.上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240；2.上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200025）

為研究加拿大一枝黃花提取物對藻類生長抑制作用的分子機理，應(yīng)用iTraq技術(shù)結(jié)合LC-MS-MS，分析了銅綠微囊藻細(xì)胞蛋白質(zhì)的差異表達.共鑒定出261種差異蛋白（變化倍數(shù)≥1.5），其中表達上調(diào)的220種，表達下調(diào)的41種.GO功能分類顯示，加拿大一枝黃花提取物通過影響細(xì)胞代謝過程、蛋白質(zhì)催化和結(jié)合功能等方式抑制藻細(xì)胞生長.KEGG通路分析表明，通路大類中富集程度位于前3位的均是代謝通路，包括能量代謝、碳水化合物代謝和氨基酸代謝，通路中富集程度最高的是糖酵解/糖異生通路.本研究發(fā)現(xiàn)了加拿大一枝黃花提取物對藻細(xì)胞生長抑制作用的分子靶點，為從分子層面闡明其抑藻作用提供參考，也為研究植物化感物質(zhì)的抑藻機理提供了新方法.

iTraq標(biāo)記；化感作用；差異表達蛋白組；抑藻機理

研究證實加拿大一枝黃花提取物能夠有效抑制藻類的生長［1-2］，但其作用機理尚不清楚.目前，對植物化感物質(zhì)抑藻機理的研究多集中在細(xì)胞的生理生化過程，雖然分子水平的研究起步較晚，但研究者普遍認(rèn)為植物化感物質(zhì)能夠影響藻細(xì)胞基因和蛋白的合成和表達［3-5］.從現(xiàn)有報道看，與植物化感物質(zhì)抑藻機理相關(guān)的分子水平研究多是從基因表達的角度來考慮［6-8］，然而，蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，其特有的活動規(guī)律幾乎無法從基因水平的研究來獲知.

蛋白組學(xué)和基因組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域的研究中得到普遍應(yīng)用，為從生物整體的蛋白和基因的表達及功能的角度闡明生命現(xiàn)象提供了依據(jù).然而，該類技術(shù)尚未在植物化感抑藻研究領(lǐng)域廣范展開.近年來，蛋白組學(xué)技術(shù)在原有基礎(chǔ)上改進和衍生出許多新的技術(shù)，其中同位素標(biāo)記相對和絕對定量（iTraq）技術(shù)［9］是2004年美國AB SCIEX公司研發(fā)的一種最新的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，具有較好的定量效果、較高的重復(fù)性和工作通量，還提高了蛋白質(zhì)組的覆蓋率和鑒定的可信度.鑒于以上優(yōu)點，iTraq技術(shù)已經(jīng)被越來越多的研究者采用，已成功應(yīng)用于酵母菌株［10］、小鼠肝臟［11］、人體皮膚［12］、子宮內(nèi)膜組織［13］、肺腺癌細(xì)胞膜蛋白［14］等多種樣品的蛋白質(zhì)組的鑒定和定量研究，但目前尚無將iTraq技術(shù)應(yīng)用于植物化感物質(zhì)的抑藻機理的研究報道.

本文采用iTraq標(biāo)記結(jié)合LC-MS-MS技術(shù)，對加拿大一枝黃花提取物作用下的銅綠微囊藻細(xì)胞全蛋白質(zhì)組進行鑒定，并對差異蛋白進行生物信息學(xué)分析，為從分子層面闡明加拿大一枝黃花提取物的抑藻機理提供參考.

1 材料與方法

1.1 藻種的培養(yǎng)

銅綠微囊藻（FACHB 942）購自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫.采用BG-11培養(yǎng)基在人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃，光照強度3000～4000lx，光暗周期14L：10D，靜置培養(yǎng).

1.2 加拿大一枝黃花提取物的制備

在上海交通大學(xué)閔行校區(qū)采集加拿大一枝黃花當(dāng)年新出苗植株，植株生長土壤為潴育水稻土中的溝干泥、黃泥頭，土壤有機質(zhì)含量約為2％～3％，pH值呈中性或微堿性.加拿大一枝黃花提取物的制備采用以下方法［15］：植物葉片在80℃條件下烘干48h；取粉碎后的植物粗顆粒，用95％乙醇在室溫下避光提??；乙醇提取液過濾后，50℃下采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到乙醇浸膏；乙醇浸膏用蒸餾水溫浸，攪拌使之懸浮，用石油醚反復(fù)萃取去除其中非極性組分，剩余溶液即為含有水溶性抑藻活性成分的提取物，4℃冷藏備用，使用前經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾.提取物的濃度以水溶性成分的濃度計算（g/L）.

1.3 試劑和儀器

細(xì)胞裂解液含40mmol/L Tris/HCl pH7.4、8mol/L Urea、0.2mmol/L Na3VO4、1mmol/L EDTA、1mmol/L NaF、0.5mmol/L EGTA、4％CHAPS、20mmol/L DTT，使用前加入1mmol/L PMSF.還原液含6mol/L鹽酸胍和100mmol/L NH4HCO3.Solution A含98％超純水，2％乙腈，0.1％甲酸.iTRAQ?試劑盒由美國AB Sciex公司提供.

液相色譜為1100LC（美國安捷倫科技公司）.LC-MS-MS為Dionex ultimate3000Nano LC（美國ThermoFisher Dionex公司）和On-line Nano Electrospray，maxis impact Q-TOF（德國Bruker公司）.

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗設(shè)置 BG11培養(yǎng)基置于250mL錐形瓶中，接入對數(shù)生長期的銅綠微囊藻，添加0.2g/L的加拿大一枝黃花提取物，對照不添加提取物.

1.4.2 全蛋白的制備 通過離心分別收集加拿大一枝黃花提取物作用3d的藻細(xì)胞和對照細(xì)胞，加入5mL 4℃預(yù)冷細(xì)胞裂解液，在冰上進行超聲破碎.將細(xì)胞破碎液在4℃下，15000r/min離心45min，取上清液，加入25mL的乙醇/丙酮/乙酸（50/50/0.1，V/V/V），-20℃沉淀過夜.沉淀后的細(xì)胞液在4℃下，15000r/min離心1h，沉淀用丙酮重懸，50℃下離心濃縮.用還原液重溶沉淀，-20℃保存?zhèn)溆?蛋白質(zhì)濃度采用Bradford法測定.1.4.3 酶解和標(biāo)記 200μg蛋白用還原液定容至100μL，采用iTRAQ?試劑盒進行酶解和標(biāo)記.酶解步驟如下：加入4μL Reducing Reagent，60℃水浴1h；加入2μL Cysteine-Blocking Reagent，室溫放置10min；將蛋白溶液加入10KD超濾管中，4℃下12000r/min離心20min，棄掉收集管底部溶液；加入100μL Dissolution Buffer，4℃下12000r/ min離心20min，棄掉收集管底部溶液；更換新的收集管，在超濾管中加入50μL（80μg/mL）胰蛋白酶液，37℃反應(yīng)過夜.標(biāo)記步驟如下：超濾管在4℃下12000r/min離心20min；在超濾管中加入50μL Dissolution Buffer，4℃下12000r/min離心20min，重復(fù)1次；合并收集管底部濾液，用Dissolution Buffer定容至100μL；iTraq試劑平衡至室溫，每管中加入150μL乙醇；取100μg酶解產(chǎn)物，加入全部iTraq試劑，室溫反應(yīng)2～3h；加入100μL超純水終止反應(yīng)；分別取加拿大一枝黃花提取物作用的藻細(xì)胞和對照細(xì)胞的標(biāo)記后的酶解產(chǎn)物，等體積混合，50℃離心濃縮，-20℃保存?zhèn)溆?

1.4.4 多肽混合物高pH反相分級 將標(biāo)記樣品用120μL流動相A復(fù)溶，12000r/min離心20min，通過液相色譜分離樣品.色譜柱為Durashell-C18柱（4.6mm×250mm，5μm），柱溫為20℃；進樣量為100μL；流動相A為pH10的20mmol/L甲酸胺，流動相B為pH10的20mmol/L甲酸胺和80％的乙腈；流速為0.8mL/min；檢測波長為214nm.采用梯度洗脫：0～5min，5％流動相B；5～30min，5％～15％流動相B；30～45min，15％～38％流動相B；45～46min，38％～90％流動相B；46～54.5min，90％流動相B；54.5～55min，90％～5％流動相B；55～65min，5％流動相B.從8min開始收集洗脫物，每個樣品約1mL，60min結(jié)束收集，共收集42份洗脫物.洗脫物分別在50℃離心濃縮，得到樣品粉末，-20℃保存?zhèn)溆?

1.4.5 蛋白質(zhì)分析 分離所得的樣品分別用30μL Solution A復(fù)溶.依據(jù)樣品收集的時間，將樣品合并為6份，通過LC-MS-MS進行蛋白質(zhì)檢測.色譜條件：捕集柱（trap column）為C18柱（0.1mm×2cm，5μm），流速為10μL/min；分析柱（Analytical Column）為C18柱（0.075mm×0.15cm，3μm），流速為400nL/min；柱溫為50℃；流動相A為含0.1％甲酸的超純水，流動相B為0.1％甲酸的乙腈.采用梯度洗脫：0～2min，2％～8％流動相B；2～75min，8％～20％流動相B；75～93min，20％～35％流動相B；93～98min，35％～80％流動相B；98～118min，80％流動相B.質(zhì)譜檢測條件：電離模式為正離子nanospray模式；質(zhì)譜檢測方式為MS全掃描及MS/MS掃描，掃描范圍50～2500amu；母離子設(shè)為350～1500m/z.

蛋白鑒定采用Mascot 2.4軟件鑒定多肽分子，肽段質(zhì)量誤差（Peptide mass tolerance）為20ppm，串聯(lián)質(zhì)譜誤差（MS/MS tolerance）為0.05Da，允許最大的胰酶漏切位點數(shù)（Max missed cleavages）為2個，NCBInt數(shù)據(jù)庫選用Microcystis aeruginosa.fasta.Mascot結(jié)果采用Scaffold 4軟件過濾，蛋白陽性結(jié)果錯誤率（Protein FDR）≤2％，肽段陽性結(jié)果錯誤率（Peptide FDR）≤1％.得到表達差異量的結(jié)果，變化倍數(shù)（Fold Change Ratio）1.5倍以上，認(rèn)為二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

1.4.6 生物信息學(xué)分析 采用blast2go 2.7.0將變化倍數(shù)1.5倍以上的差異蛋白和參考菌株M.aeruginosa NIES-843的全蛋白質(zhì)分別與NCBInt數(shù)據(jù)庫比對，對應(yīng)蛋白分別在基因本體（Gene Ontology，GO）3個分支——生物過程（Biological Process），分子功能（Molecular Function）和細(xì)胞組件（Cellular Component）——進行功能上的分類統(tǒng)計.

從KEGG網(wǎng)站下載了M.aeruginosa NIES-843的蛋白序列和其它相關(guān)信息作為KEGG分析的參照數(shù)據(jù)集，將差異蛋白序列和參照數(shù)據(jù)集進行序列相似性比對，采用相似度≥30％且evalue≤1×10-10進行雙向最佳匹配（Bi-direction Best Hit，BBH）.通過參照集的ID號映射到KEGG Pathway maps，以參照數(shù)據(jù)集的全部蛋白質(zhì)為參照在通路水平和通路大類的水平進行計算P值，與此同時計算Z-score.Z-score＞0且P＜0.05，即顯著富集.

通過BBH結(jié)果將匹配到的差異蛋白質(zhì)定位到M.aeruginosa NIES-843基因組上，獲得編碼基因的相關(guān)信息.

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白鑒定和差異蛋白篩選

以未經(jīng)加拿大一枝黃花提取物作用的藻細(xì)胞為對照，共鑒定出576種差異蛋白，而差異倍數(shù)達到1.5倍的差異蛋白共261種，占到所鑒定的蛋白總數(shù)的45.3％，其中表達上調(diào)的差異蛋白220種，表達下調(diào)的蛋白41種，上調(diào)蛋白數(shù)是下調(diào)蛋白數(shù)的5.4倍.表1顯示了上調(diào)和下調(diào)前10位的蛋白.

2.2 GO功能分類和顯著性分析

基因本體（GO）是一個在生物信息學(xué)中廣泛使用的本體，基因產(chǎn)物在數(shù)據(jù)庫中被賦上GO的詞條，進而可以到數(shù)據(jù)庫中去查詢這些生物學(xué)的相關(guān)信息.通過GO功能分類對蛋白功能進行聚類分析，第二層GO功能分類結(jié)果見表2.鑒定到的差異蛋白中193種能對應(yīng)到生物過程，其第二層功能分類中180種蛋白參與代謝過程，占93％，第三層分支中，最多蛋白參與的是有機物代謝過程和初級代謝過程，均有109種蛋白，其次是生物合成過程（80種）和細(xì)胞代謝過程（78種）.鑒定到的差異蛋白中191種能對應(yīng)到分子功能，其第二層功能分類以催化和結(jié)合為主，分別有160和134種相關(guān)蛋白.催化功能的下層分支中，水解酶和轉(zhuǎn)移酶最多，分別為45和38種蛋白；結(jié)合功能的下層分支中，具有與雜環(huán)化合物和有機環(huán)狀化合物結(jié)合功能的蛋白最多，均有80種蛋白，其次是具有與小分子結(jié)合功能的蛋白（71種）.鑒定到的差異蛋白中81種能對應(yīng)到細(xì)胞組件.第二層GO分支中，這81種蛋白均屬于細(xì)胞（cell），其中的39種蛋白還同時屬于大分子復(fù)合物.第三層GO功能細(xì)胞分支中，有75種蛋白屬于細(xì)胞部分（cell part）；第三層GO功能大分子復(fù)合物分支中，有30種蛋白屬于蛋白質(zhì)復(fù)合物.這說明加拿大一枝黃花提取物作用下藻細(xì)胞的代謝過程顯著變化，蛋白的催化功能和結(jié)合功能受到明顯影響，而差異蛋白主要位于胞內(nèi).

表1 銅綠微囊藻差異蛋白中差異倍數(shù)前10位的蛋白Table 1 Top 10 fold change ratios in differentially expressed proteins of M.aeruginosa

以M.aeruginosa NIES-843的全蛋白為參照，采用fisher’s exact test檢驗實驗細(xì)胞在GO功能上的差異，得到的P值通過Bonferroni correction進行矯正.表3顯示了富集度最高的5個功能分支.相比參考物種，代謝過程、小分子結(jié)合和細(xì)胞內(nèi)組件在分別生物過程、分子功能和細(xì)胞組件功能分支中差異蛋白富集程度最高.在GO功能分類中，能對應(yīng)到生物過程的差異蛋白中超過90％與代謝過程相關(guān)，下層分支中分解代謝過程、初級代謝過程、有機物代謝過程、生物合成過程和細(xì)胞代謝過程顯著富集，與這些過程相關(guān)的蛋白質(zhì)代謝、碳水化合物代謝、細(xì)胞生物合成、有機質(zhì)生物合成和細(xì)胞大分子生物合成等過程同樣顯著富集.同樣顯著富集還有抗氧化活性，其對應(yīng)的差異蛋白占2.30％（6種），遠高于參照物種的0.19％，包括1種過氧化物酶、2種過氧化氫酶和3種谷胱甘肽還原酶，與前期研究中抗氧化系統(tǒng)對加拿大一枝黃花提取物的響應(yīng)的結(jié)論一致［1］.

表2 銅綠微囊藻細(xì)胞差異蛋白的第二層GO功能分類Table 2 Level 2 of GO terms in differentially expressed proteins of M.aeruginosa

表3 GO功能分類中生物過程、分子功能和細(xì)胞組件前5位富集度的功能分類Table 3 Top 5 enrichment GO terms in biological process，molecular function and cellular component

2.3 KEGG通路分析

KEGG是由京都大學(xué)生物信息學(xué)中心于1995年建立的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，其中的Pathway數(shù)據(jù)庫可以計算或預(yù)測出蛋白質(zhì)在對各種細(xì)胞活動的交互作用，包括圖解的細(xì)胞生化過程和同系保守的子通路等信息.BBH結(jié)果顯示有183種（70.8％）蛋白對應(yīng)到參照數(shù)據(jù)集，共對應(yīng)到60條KEGG通路，這些通路分別對應(yīng)15個通路大類，表4顯示了富集程度位于前5位的通路大類，其中位于前3位的均是執(zhí)行代謝功能的通路大類，包括能量代謝、碳水化合物代謝和氨基酸代謝.60條通路中的22條顯著富集，表5顯示了富集程度位于前10位的通路，其中糖酵解/糖異生通路富集度最高，其次是氨酰-tRNA酶生物合成合成通路、氮代謝通路和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成通路.結(jié)果進一步說明加拿大一枝黃花提取物對藻細(xì)胞代謝過程的影響最顯著的是能量代謝.差異蛋白對應(yīng)到的15各通路大類中有10個屬于代謝過程（4個顯著富集），這與GO功能的結(jié)果類似.研究證實光合系統(tǒng)是植物化感抑藻物質(zhì)影響藻細(xì)胞生長的重要靶點［16-18］，結(jié)果顯示在對應(yīng)KEGG通路中有3個與細(xì)胞光合生理相關(guān)，包括光合作用、光合作用-天線蛋白和碳固定，分別涉及6、5和5種蛋白.

表4 銅綠微囊藻細(xì)胞差異蛋白前5位顯著富集的通路大類Table 4 Top 5 enrichment KEGG pathway classes in differentially expressed proteins of M.aeruginosa

表5 銅綠微囊藻細(xì)胞差異蛋白前10位顯著富集的通路Table 5 Top 10 enrichment KEGG pathways in differentially expressed proteins of M.aeruginosa

2.4 基因組定位

將BBH得到的183種差異蛋白質(zhì)分別定位到M.aeruginosa NIES-843基因組上，得到各蛋白對應(yīng)編碼基因的相關(guān)信息.表6為上調(diào)和下調(diào)前5位的蛋白對應(yīng)的編碼基因.

2.5 差異蛋白的生物信息學(xué)分析

根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，加拿大一枝黃花提取物對藻細(xì)胞的作用是多方面的，其能夠同時影響多種物質(zhì)代謝合成及干擾不同的生理生化反應(yīng)的進行，通過這些信息還能夠進一步解析差異蛋白的功能.

表達上調(diào)的蛋白中，1-（5-phosphoribosyl）-5-（（5-phosphoribosylamino）methylideneamino）imidazole-4-carboxamide isomerase的差異最大，實驗組為對照組的32.3倍.根據(jù)生物信息學(xué)分析，該酶由hisA基因編碼，參與生物合成，具有催化功能，在KEGG通路中參與組氨酸代謝.上調(diào)差異倍數(shù)第二的是6-磷酸果糖激酶（6-phosphofructokinase），差異倍數(shù)為22.2.該酶是糖酵解途徑的限速酶，負(fù)責(zé)催化ATP上的磷?；D(zhuǎn)移給6-磷酸果糖，生成1，6-二磷酸果糖和ADP，但會受到高濃度ATP的抑制［19］.根據(jù)生物信息學(xué)分析，該酶編碼基因可定位于M.aeruginosa NIES-843基因組上WP_002770220.1位置，與細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)（包括核酸堿基、雜環(huán)化合物、含氮化合物、芳香族化合物等）的代謝過程相關(guān)，具有催化和結(jié)合功能，在KEGG通路中參與糖酵解/糖異生、果糖和甘露糖代謝、半乳糖代謝、甲烷代謝.上調(diào)差異倍數(shù)第三的是熱休克蛋白（Heat shock protein），差異倍數(shù)為22.1.熱休克蛋白是生物體或細(xì)胞在不良環(huán)境因素作用下產(chǎn)生的具有高度保守性的應(yīng)激蛋白，不僅能為熱損傷所誘導(dǎo)，而且能為許多其它應(yīng)激刺激所誘導(dǎo)，包括生理、病理、環(huán)境乃至機械刺激等方面，如缺氧、葡萄糖缺乏、重金屬、代謝抑制因子、氧自由基、病毒感染、寄生蟲感染［20］.研究證實加拿大一枝黃花提取物作用下銅綠微囊藻會產(chǎn)生過量的活性氧，進而形成氧脅迫［1］，這可能是導(dǎo)致熱休克蛋白上調(diào)的原因.根據(jù)生物信息學(xué)分析，該蛋白由dnaK基因編碼，與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和大分子的代謝過程相關(guān)，參與應(yīng)激反應(yīng)，具有與二磷酸核苷和核苷酸結(jié)合的功能，在KEGG通路中參與RNA降解.

表6 銅綠微囊藻差異蛋白中差異倍數(shù)前5位的蛋白對應(yīng)的編碼基因Table 6 Gene of top 5 fold change ratios in differentially expressed proteins of M.aeruginosa

差異蛋白中差異倍數(shù)最小的為0.4，即表達下調(diào)最顯著，包括3種蛋白：50S核糖體亞基蛋白L23（50S ribosomal subunit protein L23）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）以及陰離子轉(zhuǎn)運ATP酶（Anion-transporting ATPase，Similar to tr|P72799）.50S核糖體亞基是原核細(xì)胞內(nèi)70S核糖體中的較大亞基，由5S rRNA、23S rRNA和約35種核糖體蛋白質(zhì)構(gòu)成，在原核翻譯中負(fù)責(zé)在tRNA轉(zhuǎn)運來的氨基酸分子之間形成肽鍵，50S核糖體亞基還是某些抗生素的結(jié)合位點，這些抗生素可通過阻斷肽鏈的延伸來抑制蛋白的質(zhì)生物合成，最終殺滅細(xì)菌［21-22］.根據(jù)生物信息學(xué)分析，50S核糖體亞基蛋白L23由rplW基因編碼，與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝、合成過程和基因表達翻譯相關(guān)，具有與RNA結(jié)合的功能，在KEGG通路中參與核糖體翻譯.谷氨酰胺合成酶是一種參與將無機氮同化為有機氮的酶，可以催化銨離子與谷氨酸反應(yīng)合成谷氨酰胺，同時消耗ATP［23］.該酶由glnN基因編碼，與細(xì)胞內(nèi)生物合成和碳水化合物代謝相關(guān)，具有催化功能，在KEGG通路中參與丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、氮代謝和雙組分系統(tǒng).離子轉(zhuǎn)運ATP酶是廣泛存在于生物膜上的一種酶蛋白，參與離子的主動轉(zhuǎn)運.陰離子轉(zhuǎn)運ATP酶編碼基因可定位于M.aeruginosa NIES-843基因組上WP_002776170.1位置，與細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)（包括核酸堿基、雜環(huán)化合物、含氮化合物、芳香族化合物等）的代謝過程相關(guān)，具有與二磷酸核苷和核苷酸結(jié)合的功能以及轉(zhuǎn)移含磷基團的活性，但在KEGG通路沒有找到對應(yīng)通路.

3 結(jié)論

3.1 通過對加拿大一枝黃花提取物作用下的銅綠微囊藻細(xì)胞蛋白質(zhì)組進行分離和鑒定，比較對照細(xì)胞和實驗細(xì)胞，共鑒定出576種差異蛋白，其中差異倍數(shù)達到1.5倍的差異蛋白共261種，包括220種表達上調(diào)的差異蛋白和41種表達下調(diào)的差異蛋白.

3.2 通過GO功能分類對蛋白功能分別進行3個分支的聚類分析.鑒定到的差異蛋白中193種能對應(yīng)到生物過程，其中180種蛋白參與代謝過程，占93％；鑒定到的差異蛋白中191種能對應(yīng)到分子功能，其中以催化和結(jié)合功能為主，分別有160和134種相關(guān)蛋白；鑒定到的差異蛋白中81種能對應(yīng)到細(xì)胞組件，第二層分支中這81種均屬于細(xì)胞，其中的39種蛋白還同時屬于大分子復(fù)合物.

3.3 差異蛋白中有183種能對應(yīng)到參照數(shù)據(jù)集，對應(yīng)15個通路大類，能匹配到60條KEGG通路中，其中22條顯著富集，位于前3位的均是執(zhí)行代謝功能的通路.

3.4 加拿大一枝黃花提取物于銅綠微囊藻細(xì)胞時，能夠同時影響多種物質(zhì)代謝合成途徑及干擾不同的生理生化反應(yīng)，其中受到影響最大的是細(xì)胞的代謝功能，尤其是能量代謝和氨基酸代謝過程.

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Differentially expressed proteins in Microcystic aeruginosa with Solidago canadensis L.extracts using iTraq labeling technique.

HUANG Ying-ying1，BAI Yu1，WANG Yan1，2*，KONG Hai-nan1（1.School of Environmental Science and Engineering，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China；2.School of Public Health，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200025，China）.China Environmental Science，2015，35（6）：1822～1830

To investigate antialgal mechanism of Solidago canadensis L.extracts，iTraq labeling technique coupled with LC-MS-MS was used to analyze differentially expressed proteins in Microcystic aeruginosa.261 differentially expressed proteins（fold change ratio≥1.5）were identified，in which 220 proteins were upregulated and 41proteins were down-regulated.GO function analysis showed that the extracts of S.canadensis inhibited the algal growth by affecting metabolism process，protein catalytic activity and binding function.KEGG pathway analysis showed that top 3 enrichment pathway classes were all related to metabolism，including energy，carbohydrate and amino acid metabolism，and glycolysis/gluconeogenesis was the top enrichment pathway.This study elucidated the molecular targets of the extracts of S.canadensis，thereby giving insight into the antialgal effects at the molecular level and providing a new way to study the antialgal mechanism of plant allelopathic compounds.

iTraq labeling；allelopathy；differentially expressed protein；antialgal mechanism

X172

A

1000-6923（2015）06-1822-09

黃瑩瑩（1984-），女，廣西柳州人，上海交通大學(xué)博士研究生，主要從事湖庫生態(tài)及藻類控制技術(shù)研究.發(fā)表論文2篇.

2014-10-30

國家自然科學(xué)基金（21077074）

* 責(zé)任作者，研究員，wangyan66@sjtu.edu.cn