王 曼 李樹(shù)仁 高 青 齊曉勇 黨 懿 張飛飛 荀麗穎

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

隨著溶栓和急診冠脈介入的廣泛開(kāi)展，急性心肌梗死的死亡率已降至5%左右。但是心肌梗死后心室重構(gòu)和缺血性心肌病的發(fā)生嚴(yán)重影響了心肌梗死患者的預(yù)后。使心肌細(xì)胞再生乃至衰竭的心臟恢復(fù)功能仍是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。基礎(chǔ)及臨床試驗(yàn)均提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)可參與受損心肌的重建，可以提高左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，降低左心室收縮末期和舒張末期容積、減少梗死面積并改善左室重構(gòu)〔1，2〕。但是BMSCs在梗死心肌中的長(zhǎng)期存活仍未能解決〔3〕。心肌梗死后微環(huán)境的改變限制了干細(xì)胞的修復(fù)能力，本文采用Bcl-2基因修飾的BMSCs移植，作為提高移植細(xì)胞存活率的手段，以達(dá)到BMSCs移植進(jìn)一步增強(qiáng)其抑制心室重構(gòu)，改善心梗后心功能的作用。

1 材料方法

1.1 主要試劑和儀器 Percoll細(xì)胞分離液(Pharmacia公司，美國(guó));低糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone公司，美國(guó));腺病毒(由漢恒生物技術(shù)有限公司合成);生物安全柜(Heal Force-1200，中國(guó));倒置顯微鏡(Olympus-ck30，日本);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus Fzsw-BB15，德國(guó));熒光顯微鏡(Leica DMI3000，德國(guó));超聲儀(Vividi，美國(guó));Trizol Reagent(Invitrogen公司，美國(guó));反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司，美國(guó));熒光定量試劑盒 Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I)(BBI公司，美國(guó));7300實(shí)時(shí)定量 PCR儀(ABI公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs細(xì)胞分離、培養(yǎng) 無(wú)菌條件下采集兔(3月齡)股骨骨髓(4～5 ml)，肝素抗凝(300 U/ml)，用DMEM培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋樣品，按照1∶1的比例將上述細(xì)胞懸液緩慢滴加到Percoll細(xì)胞分離液中(密度1.073 g/ml)，2 000 r/min 離心20 min。取位于中間的乳白色云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層，加入培養(yǎng)液稀釋混勻，離心洗滌2遍，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以2.0×105個(gè)/cm2的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后棄掉未貼壁細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)液，以后每3天換液一次，細(xì)胞長(zhǎng)到80%融合時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶2傳代進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)〔4〕。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.2.2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為兩組(腺體病毒載體和等滴度同體積的對(duì)照病毒載體)。每組均有不同梯度的感染復(fù)數(shù)(MOI)，感染36～48 h觀察感染情況，確定最佳MOI均為500。

1.2.2.2 Bcl-2正式轉(zhuǎn)染BMSCs 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第9代BMSCs，消化后以3×105個(gè)/ml細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后倒掉細(xì)胞培養(yǎng)基，以PBS沖洗3次，于培養(yǎng)瓶中加入無(wú)血清培養(yǎng)基1 ml，再加入含Ad-EGFP-Bcl-2或Ad-EGFP的病毒液(MOI=500)轉(zhuǎn)染MSCs，轉(zhuǎn)染2 h內(nèi)每隔15 min搖晃1次。2 h后倒掉轉(zhuǎn)染的病毒液，以PBS沖洗培養(yǎng)瓶后加入含10%FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后72 h移植入動(dòng)物體內(nèi)。

1.2.3 心肌梗死后心功能不全模型制作 選用24只體重3.0 kg左右的新西蘭家兔，雄性，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔動(dòng)物中心許可證號(hào)為SCXK(冀)2008-1-03〕。3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉(1 ml/kg)，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，20 min后測(cè)定心電圖，將針形電極插入皮下1 cm，采用針形電極插入四肢和胸部皮下，標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)和aVR、aVL、aVF單極加壓肢體導(dǎo)聯(lián)的連接方法與人基本相同，胸導(dǎo)聯(lián)取V1、V3、V5。定準(zhǔn)電壓為1 mV=10 mm(10小格)，紙速25 mm/s。常規(guī)消毒、鋪巾。剪開(kāi)胸部左側(cè)皮膚，鈍性分離皮下組織及肌肉至肋骨。沿胸骨左緣切斷第3、4、5肋骨。放置開(kāi)胸器暴露心包。打開(kāi)心包，暴露左冠狀動(dòng)脈前降支，在中段處用絲線結(jié)扎，可以見(jiàn)到心尖部及部分左室前壁心肌變紫〔5，6〕。逐層關(guān)胸。再次記錄心電圖。

1.2.4 細(xì)胞移植 建模14 d后再次開(kāi)胸。選取心肌梗死周邊區(qū)域4個(gè)注射點(diǎn)分別將 600 μl的含1.0 × 107個(gè)BMSCs(Ad-EGFP-Bcl-2-BMSCs和Ad-EGFP-BMSCs)懸液注入梗死灶邊緣區(qū)域;DMEM組注射等體積的無(wú)血清DMEM。

1.2.5 心臟超聲 采用Vivid i超聲心動(dòng)圖儀在術(shù)前、術(shù)后14 d及細(xì)胞移植后28 d由同一?？漆t(yī)生進(jìn)行超聲心動(dòng)圖測(cè)量左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室縮短分?jǐn)?shù)(FS)、左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)。所有測(cè)量值均取3次測(cè)量的平均值。

1.2.6 心臟取材及切片 細(xì)胞移植28 d后處死動(dòng)物，剪開(kāi)心包膜，暴露心臟，注意心包的光澤度及心包內(nèi)液體的情況，心臟的大小、外形、心外膜的情況，迅速取下心臟，冰鹽水沖洗干凈，在相應(yīng)梗死周邊區(qū)切取標(biāo)本，將標(biāo)本放入-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｈ」Ｋ肋吘墔^(qū)心肌制成6 μm厚冰凍切片，用熒光顯微鏡觀察移植細(xì)胞存活情況。取左心室心肌組織，用4%多聚甲醛液固定，然后常規(guī)石蠟包埋，切片厚5 μm，HE染色后光鏡觀察組織學(xué)形態(tài)變化。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)心肌組織Bcl-2表達(dá) 提取梗死邊緣區(qū)心肌組織50 mg，按照Trizol Reagant說(shuō)明書提取總RNA(其 A260/280比率高于1.9;用凝膠電泳觀察是完整無(wú)損的;不含反轉(zhuǎn)錄或 PCR抑制劑)，42℃ 反轉(zhuǎn)錄50 min，95℃ 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。GAPDH和Bcl-2基因由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列:GAPDH:92 bp，上游5'-CAA GAA GGT GGT GAA GCA GG-3';下游5'-CAC TGT TGA AGT CGC AGG AG-3'〔5，6〕，Bcl-2:70 bp，上游 5'-ATA ACG GAG GCT GGG ATG-3'，下游 5'-CAG GAG AAA TCA AAC AGA GGC-3'。熒光定量PCR熱循環(huán)參數(shù):96℃ 4 min，然后三步反應(yīng):94℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以 GAPDH 為內(nèi)參照基因，將目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值RQ用于統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)時(shí)定量PCR采用2-△△Ct(△Ct=目的基因 Ct值-GAPDH Ct值，△△Ct=目的基因△Ct值-參照基因△Ct值)法統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果〔7〕。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

圖1 BMSCs形態(tài)觀察(×40)

2.1 BMSCs形態(tài)觀察 圖1可見(jiàn)，用Percoll液(1.073 g/ml)梯度離心從骨髓中分離單個(gè)核細(xì)胞，接種于培養(yǎng)液中，72 h后出現(xiàn)散在的紡錘狀貼壁細(xì)胞，10～14d后形成克隆，MSC貼壁稀疏時(shí)，長(zhǎng)梭形細(xì)胞的兩極朝向不規(guī)律，細(xì)胞排列混亂，細(xì)胞之間往往通過(guò)突起相連接。約3 w出現(xiàn)致密的貼壁細(xì)胞層，此時(shí)細(xì)胞的兩極開(kāi)始有規(guī)律地排列成束狀，有的呈漩渦狀。每瓶單層融合的MSC用胰蛋白酶消化后平均獲得(5.5±0.17)×105個(gè)細(xì)胞，將這些細(xì)胞再傳代培養(yǎng)，傳代后細(xì)胞24 h完全貼壁，3～5 d即可達(dá)80% ～90% 融合。

2.2 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞 轉(zhuǎn)染24～48 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到EGFP標(biāo)記的BMSCs。最佳MOI為500。熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染效率100%，形態(tài)比較均勻一致，但增殖速度減慢。見(jiàn)圖2。

2.3 動(dòng)物心功能不全模型結(jié)果 造模時(shí)心電圖可見(jiàn)相應(yīng)導(dǎo)聯(lián)ST段抬高，結(jié)扎后該供血區(qū)域心肌變白，造模后存活21只，死亡的主要原因?yàn)槁樽硪馔?、氣胸? w后根據(jù)心臟彩超結(jié)果及造模成功判定標(biāo)準(zhǔn)(LVEF≤50%)，共有18只造模成功。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為Ad-EGFP-Bcl-2組、Ad-EGFP組和DMEM組各6只。實(shí)驗(yàn)兔各組動(dòng)物體重比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異〔(3.409±0.103)kg，(3.418 ±0.092)kg，(3.374 ±0.133)kg，P=0.774〕。

2.4 心臟超聲檢查 術(shù)前心功能均正常。BMSCs移植后4 w，Ad-EGFP-Bcl-2組和 Ad-EGFP組與 DMEM組相比，均優(yōu)于DMEM組，Ad-EGFP-Bcl-2組LVEF值明顯高于Ad-EGFP組及DMEM組，EDD數(shù)值小于Ad-EGFP組及DMEM組。Ad-EGFP組比DMEM組LVEF提高EDD減小(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.5 PCR結(jié)果 Ad-EGFP-Bcl-2組與Ad-EGFP組及DMEM組相比，Bcl-2表達(dá)量均增加明顯(P＜0.05)。Ad-EGFP組與DMEM組相比，Bcl-2表達(dá)增加(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖2 不同MOI轉(zhuǎn)染效果

表1 移植4 w后兔心功能測(cè)定及心肌組織Bcl-2 mRNA表達(dá)(x ± s，n=6)

2.6 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞存活 細(xì)胞移植28 d后，處死家兔后，取梗死周邊區(qū)域心肌組織，經(jīng)冰凍切片機(jī)切片后，在熒光顯微鏡下可觀察到的經(jīng)EGFP標(biāo)記的移植BMSCs。Ad-EGPFBcl-2組多于Ad-EGFP組。見(jiàn)圖3。

圖3 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞存活(×40)

2.7 病理學(xué)變化 正常心肌細(xì)胞纖長(zhǎng)，平行排列且整齊，包質(zhì)染色均勻，核小，圓形或橢圓形，組織間隙無(wú)炎性滲出。模型組心肌有壞死，部分心肌纖維斷裂，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖4。

圖4 心肌病理切片觀察(HE，×40)

3 討論

心肌梗死后最終引起心功能不全是患者死亡的主要原因。現(xiàn)行的治療方法不能從根本上修復(fù)壞死的心肌組織〔8〕。MSC是人們研究最深入的干細(xì)胞種類之一，特別是在修復(fù)病患及損傷組織、器官方面。MSCs存在于多種成體組織內(nèi)，骨髓是MSCs的主要來(lái)源。自體和異體的MSC都被證明能夠參與組織再生。異體間充質(zhì)干細(xì)胞移植能夠發(fā)揮作用可能因其具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能〔9〕。

本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎家兔前降支使血管急性閉塞建立心肌梗死后心功能不全模型，移植第9代基因修飾及非基因修飾同種異體細(xì)胞進(jìn)行治療，用心臟彩超評(píng)估心衰模型及治療效果，并試圖探討其可能機(jī)制。盡管家兔是心肌梗死后心衰的一種合適動(dòng)物模型，但此造模法動(dòng)物創(chuàng)傷大，與人類病理生理過(guò)程有一定差距，開(kāi)胸時(shí)易損傷肺組織，術(shù)后縱隔內(nèi)組織瘢痕愈合且容易發(fā)生粘連，為二次開(kāi)胸操作帶來(lái)一定的困難。

BMSCs移植改善梗死后心臟功能的機(jī)制可能與間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌多種因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖與血管再生建立側(cè)支循環(huán)，抑制梗死區(qū)擴(kuò)大與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)〔10〕，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)Bcl-2mRNA表達(dá)量證實(shí)移植細(xì)胞有抗心肌細(xì)胞凋亡作用，通過(guò)基因修飾的BMSCs抗凋亡作用更強(qiáng)，移植效果更佳。

BMSCs易于被外源基因轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)〔11～13〕，對(duì)其進(jìn)行基因修飾可以使BMSCs具有更好的促血管再生、抗細(xì)胞凋亡、抗炎、修復(fù)心功能的作用。外源性基因?qū)肽康募?xì)胞中有病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)采用腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，轉(zhuǎn)染效率高，無(wú)毒副作用。細(xì)胞移植也有多種途徑〔14〕，本實(shí)驗(yàn)采用直接心肌內(nèi)注射，使病變處有較高的細(xì)胞濃度，但需要二次開(kāi)胸。

Bcl-2是具有明顯抑制凋亡作用的基因，用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法抗凋亡基因修飾BMSCs后，延長(zhǎng)BMSCs存活，有助于提高其移植治療心肌梗死的效果〔15〕。單基因修飾BMSCs雖取得較好的療效。但由于心肌梗死心肌修復(fù)涉及多種機(jī)制，單種基因很難滿足治療需求，許多學(xué)者開(kāi)始多基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的探索〔16～18〕，所有結(jié)果均表明，多基因聯(lián)合可起到一定的治療效果疊加。

目前對(duì)BMSC的基因修飾研究主要為單一基因的動(dòng)物試驗(yàn)階段，但諸多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果令人鼓舞，基因工程在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死后心力衰竭中有廣泛的應(yīng)用前景。隨著研究的深入，相信會(huì)有更多的基因靶點(diǎn)和基因工程技術(shù)應(yīng)用于心肌梗死后心力衰竭的干細(xì)胞治療領(lǐng)域。

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