姚 霜，鄭 璐，于 洋，喻妙梅，潘麗莉，張 俊，馮悅?cè)A，羅光華

（蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院綜合實驗室，江蘇常州213003）

雙重?zé)晒鈱崟r定量PCR法檢測TNF-α mRNA表達(dá)水平

姚 霜，鄭 璐，于 洋，喻妙梅，潘麗莉，張 俊，馮悅?cè)A，羅光華

（蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院綜合實驗室，江蘇常州213003）

目的：建立單管檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和內(nèi)參GAPDH mRNA表達(dá)水平的雙重?zé)晒鈱崟r定量PCR方法。方法：脂多糖刺激小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1后提取細(xì)胞RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用自行設(shè)計的不同熒光標(biāo)記的TNF-α和GAPDH引物探針，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在FAM通道和CY5通道分別讀取Ct值，同時應(yīng)用基因測序技術(shù)對結(jié)果進(jìn)行驗證，并構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分析該方法的靈敏度和重復(fù)性。結(jié)果：雙重?zé)晒鈱崟r定量PCR法檢測TNF-α的靈敏度達(dá)4×101拷貝/μL，檢測線性范圍可達(dá)6個數(shù)量級，批內(nèi)和批間重復(fù)性好。結(jié)論：新方法消除了目的基因與內(nèi)參的加樣誤差，節(jié)約成本，快速準(zhǔn)確，適用于TNF-α mRNA的定量檢測。

雙重?zé)晒舛縋CR；腫瘤壞死因子-α；GAPDH

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞和炎性細(xì)胞，經(jīng)致炎因素刺激后能夠產(chǎn)生炎癥因子，調(diào)控炎癥反應(yīng)［1］。脂多糖是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要成分，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì)，通過脂多糖刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子建立體外炎癥模型，常用于某些潛在抗炎因子（如載脂蛋白M等）或藥物作用機(jī)制的研究［2］。炎癥模型建立的成功與否主要通過細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor a1pha，TNF-α），白細(xì)胞介素-1β（inter1eukin-1 beta，IL-1β）等炎癥因子的變化水平來衡量，因此，不斷探索和改進(jìn)這些炎癥因子mRNA表達(dá)水平的PCR檢測方法十分必要。本實驗以TNF-α為例，以雙重?zé)晒鈱崟r定量PCR方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的單重?zé)晒釶CR，消除了多管反應(yīng)體系造成的加樣誤差，操作簡便，準(zhǔn)確快捷，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠巨噬細(xì)胞株Ana-1購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。脂多糖（Sigma公司）。RNA提取試劑盒購于上海博彩生物科技公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TheroFish公司），PCR熱啟動酶及其反應(yīng)體系（Bio1ine公司），LightCyc1er熒光定量PCR儀（Roche公司）。

1.2 體外炎癥模型的建立

1×106個/mL的Ana-1細(xì)胞鋪6孔板，3 h后加入10 μg/mL的脂多糖，6 h后提取細(xì)胞RNA。

1.3 細(xì)胞RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

按照RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 引物及探針的設(shè)計和合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中小鼠TNF-α和GAPDH的基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計正、反義引物和探針，引物和探針均由上海生工公司合成和修飾，見表1。

表1 檢測小鼠TNF-α和GAPDH的引物探針

1.5 實時熒光PCR

總反應(yīng)體系為25 μL，包括cDNA模板2 μL，50 mmo1/L MgC12溶液1.5 μL，IMMOLASE DNA熱啟動酶0.2 μL，100 μmo1/L TNF-α及GAPDH正、反義引物和探針均為0.04 μL，40 mmo1/L 4×dNTP 1 μL，10×緩沖液2.5 μL，雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性10 min；95℃5 s，60℃27 s（溫度轉(zhuǎn)換率為4.4℃/s），共40個循環(huán)，60℃收集熒光數(shù)據(jù)。反應(yīng)在LightCyc1er 480Ⅱ型熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

1.6 質(zhì)粒載體構(gòu)建

分別構(gòu)建TNF-α及GAPDH的載體，擴(kuò)增產(chǎn)物片段送上海生工公司克隆并測序。

1.7 靈敏度和檢測范圍

分別選取TNF-α和GAPDH載體作為模板，經(jīng)10倍梯度稀釋（4×101～4×106），按上述條件進(jìn)行熒光定量RT-PCR。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)果判斷

TNF-α在FAM通道出現(xiàn)明顯“S”形擴(kuò)增曲線，在CY5通道無擴(kuò)增；GAPDH在CY5通道出現(xiàn)明顯“S”形擴(kuò)增曲線，在FAM通道無擴(kuò)增，分別讀取Ct值。

2.2 準(zhǔn)確性分析

選取TNF-α和GAPDH的樣本各一份送至上海生工公司測序，經(jīng)BLAST比對后，RT-PCR結(jié)果與測序結(jié)果一致。測序圖如圖1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏度檢測

該法檢測TNF-α和GAPDH的靈敏度均為4×101拷貝/μL，TNF-α標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y= -3.566X+42.60，r2=0.988，擴(kuò)增效率為91％。GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y=-3.541X+38.57，r2=0.996，擴(kuò)增效率為92％。其中Y代表Ct值，X代表模板量的對數(shù)值。其線性范圍可達(dá)6個數(shù)量級（圖2和圖3）。

2.4 批間重復(fù)性

將4×106拷貝/μL的TNF-α和GAPDH混合作為標(biāo)準(zhǔn)品原液進(jìn)行10倍梯度稀釋，批內(nèi)設(shè)置3個復(fù)孔，批間重復(fù)檢測3次，批內(nèi)和批間變異系數(shù)小于3.53％。見表2和表3。

2.5 脂多糖刺激Ana-1細(xì)胞前后TNF-α mRNA表達(dá)的差異

雙熒光通道RT-PCR結(jié)果顯示，脂多糖處理后Ana-1細(xì)胞表達(dá)TNF-α mRNA顯著高于對照組（t= 21.20，P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

A、B為TNF-α，C、D為GAPDH圖1 TNF-α產(chǎn)物測序圖

圖2 TNF-α不同稀釋度擴(kuò)增曲線

圖4 TNF-α mRNA在Ana-1細(xì)胞中的表達(dá)

圖3 GAPDH不同稀釋度擴(kuò)增曲線

3 討論

在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞表面的模式識別受體可以識別多種病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated mo1ecu1ar pattern，PAMP）分子啟動胞內(nèi)信號傳導(dǎo)［3］。根據(jù)活化方式的不同巨噬細(xì)胞可以分為經(jīng)典活化型（M1）和替代活化型（M2）兩種表型，脂多糖刺激后主要分化為M1a型，激活NF-κB通路表達(dá)TNF-α，IL-1β，IL-6等促炎細(xì)胞因子，而M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-10等抑炎細(xì)胞因子，降低炎癥反應(yīng)促進(jìn)組織修復(fù)［4］。TNF-α是維持體內(nèi)免疫平衡的重要介質(zhì)，在抗腫瘤、免疫防御的炎癥反應(yīng)中起重要的作用。巨噬細(xì)胞經(jīng)脂多糖刺激后在早期即可釋放大量TNF-α，TNF-α反向作用于NF-κB通路，促進(jìn)其他炎癥因子的釋放，放大了炎癥反應(yīng)［5］。因此，通常選取急性炎癥早期細(xì)胞因子TNF-α作為衡量炎癥反應(yīng)模型成功與否的標(biāo)準(zhǔn)。

表2 TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)、批間重復(fù)性

表3 GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)、批間重復(fù)性

多重PCR法通常用在同一反應(yīng)管內(nèi)檢測多個基因的表達(dá)或多種病原體。該方法縮短了檢測周期，并降低了檢測費(fèi)用。傳統(tǒng)的單重?zé)晒舛縋CR在檢測多個基因時需要多管反應(yīng)體系，不但耗費(fèi)試劑、樣本，而且還浪費(fèi)時間，較為煩瑣。

在定量研究目的基因表達(dá)水平時，通常會選取GAPDH作為內(nèi)參基因。如果用單重?zé)晒舛縋CR檢測目的基因和內(nèi)參基因，需要分兩管進(jìn)行，會在模板（cDNA）加樣環(huán)節(jié)產(chǎn)生一個加樣誤差。為避免這個誤差并減少PCR次數(shù)，本研究旨在建立一種單管快速準(zhǔn)確檢測TNF-α和GAPDH的方法，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計出針對TNF-α和GAPDH高度特異的引物和探針，分別用FAM和CY5熒光基團(tuán)標(biāo)記。在以同一濃度陽性核酸作為模板的反應(yīng)體系中，優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，根據(jù)最低Ct值選擇最佳引物和探針濃度，建立最優(yōu)化的反應(yīng)體系。LightCyc1er480Ⅱ型實時熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測后，分別在FAM和CY5通道讀取TNF-α和GAPDH的Ct值，擴(kuò)增曲線為典型的“S”形。靈敏度實驗表明，檢出限可達(dá)4×101拷貝/μL，無交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間重復(fù)性好，在106～101拷貝/μL范圍內(nèi)具有良好的線性，可以準(zhǔn)確測定TNF-α的表達(dá)量，為炎癥模型建立成功與否提供了一個準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、快速的檢測方法。利用該方法定量檢測脂多糖誘導(dǎo)前后Ana-1細(xì)胞TNF-α的表達(dá)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)組明顯高于對照組，說明炎癥模型建立成功。

［1］ Morris MC，Gi11iam EA，Li L.Innate immune programing by endotoxin and its patho1ogica1 consequences［J］.Front Immuno1，2014，5：680

［2］ Li Y，Wu Q，Deng Y，et a1.D（-）-Sa1icin inhibits the LPS-induced inf1ammation in RAW264.7ce11sand mouse mode1s［J］.Int Immunopharmaco1，2015，26（2）：286-294.

［3］ Mcnab F，Mayer-Barber K，Sher A，et a1.Type I interferons in infectious disease［J］.Nat Rev Immuno1，2015，15（2）：87-103.

［4］ Liu K，Zhao E，I1yas G，et a1.Impaired macrophage autophagy increases the immune response in obese mice by promoting proinf1ammatory macrophage po1arization［J］.Autophagy，2015，11（2）：271-284.

［5］ Napetschnig J，Wu H.Mo1ecu1ar basis of NF-κB signa-1ing［J］.Annu Rev Biophys，2013，42：443-468.

Establishment of dual fluorescent quantitative real-time PCR for detection of TNF-α

YA0 Shuang，ZHENG Lu，YU Yang，YU Miao-mei，PAN Li-ii，ZHANG Jun，F(xiàn)ENG Yue-hua，LU0 Guang-hua
（Comprehensive Laboratory，the Third Affi1iated Hospita1 of Soochow University，Changzhou Jiangsu 213003，China）

Objective：Estab1ish a dua1 f1uorescent quantitative rea1-time PCR for detection of TNF-α. Methods：The RNA was iso1ated from Ana-1 ce11 1ine after inducing by 1ipopo1ysaccharide.Primers and probes were designed according to mice TNF-α and GAPDH gene.The thresho1d cyc1es were reading through channe1 FAM and channe1 CY5，respective1y.After verifying the amp1ification resu1ts by gene sequencing，the standard p1asmid was constructed for ana1yzing the sensitivity and repeatabi1ity of the method. Results：The ana1ytica1 sensitivities of the dua1 rea1-time PCR assay for TNF-α and GAPDH reached to 4× 101copies/μL.No cross-reaction was observed during the reaction.The 1inear range and the intra-assay coefficient of variation were 4×101_4×106copies/μL and＜3.53％.Conclusion：The new method can e-1iminate the errors caused by adding samp1es.It is a simp1e，economic and suitab1e method for assaying expression of target genes.

dua1 f1uorescent quantitative RT-PCR；TNF-α；GAPDH

R393

A

1671-7783（2015）06-0524-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150190

2015-08-28 ［編輯］ 何承志

國家自然科學(xué)基金資助項目（81201352，81370372）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項目（BK2012154，BK20130244）；常州市應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（CJ20122013）

姚霜（1989—），女，碩士研究生；羅光華（通訊作者），研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mai1：shineroar@163.com