何慶，朱棟梁，張曉宇，陳開波,2，田振峰,2

1 安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司/煙草化學(xué)安徽省重點實驗室，合肥 230088;2 安徽中煙-中科大煙草化學(xué)聯(lián)合實驗室，合肥 230088

煙草與煙氣化學(xué)

不同類型煙葉中游離二肽的組成及含量差異分析

何慶1，朱棟梁1，張曉宇1，陳開波1,2，田振峰1,2

1 安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司/煙草化學(xué)安徽省重點實驗室，合肥 230088;2 安徽中煙-中科大煙草化學(xué)聯(lián)合實驗室，合肥 230088

為比較不同類型煙葉中游離二肽的組成以及含量的差異，利用甲醇/三氟乙酸溶液提取，F(xiàn)moc衍生化-液質(zhì)聯(lián)用分析煙葉中的游離二肽。結(jié)果顯示：1）通過對二肽在質(zhì)譜中斷裂模式的探討，共鑒定出烤煙煙葉中14種、白肋煙中11種、香料煙中9種游離二肽。游離二肽的含量范圍為1μg/g-120μg/g。2）不同類型煙葉在二肽種類上有一定程度的差異，谷氨酰胺（賴氨酸）-苯丙氨酸（KF/QF）以及雙丙氨肽（AA）是三種類型煙葉中共有的含量較大組分，烤煙中脯氨酰纈氨酸（PV）以及甘氨酰谷氨酰胺(賴氨酸)（GQ/GK）含量較高，白肋煙中天冬氨酰組氨酸（DH）含量較高，而香料煙中纈氨酰苯丙氨酸（VF/FV）以及谷氨酰谷氨酰胺（賴氨酸）（EK/KE）這兩種二肽含量較高。

煙草；肽；LC-MS

肽廣泛存在于食品和蛋白酶解物中，而且被認(rèn)為是美拉德反應(yīng)中重要的風(fēng)味增香劑和前體物。小分子肽與還原糖發(fā)生的美拉德反應(yīng)會產(chǎn)生大量香味成分，其中有些香味成分是肽類物質(zhì)美拉德反應(yīng)所特有的。新鮮煙葉通常含有較大量的蛋白質(zhì)[1]，煙葉在調(diào)制、復(fù)烤和醇化過程中，蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下不斷分解和轉(zhuǎn)化，降解為游離氨基酸和低分子肽[2]。其中游離氨基酸和二肽作為美拉德反應(yīng)底物，具有較強的反應(yīng)活性。煙草游離氨基酸分離鑒定已經(jīng)比較成熟，但是對于煙草游離二肽的鑒定未見報道。

近年來，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-ESI/MS）被廣泛應(yīng)用于多肽分子量及氨基酸序列的測定[3]，它大大簡化了前處理的步驟。然而，對于短鏈肽（Mr=50-400）來說，由于其弱離子化效率以及強基線干擾，增大了檢測難度，常用的液質(zhì)聯(lián)用方法往往檢測效果不理想。Ca′rdenas等[4]利用琥珀酰亞胺基-2-(3-吡啶)-乙酯（SPA）在pH=7的緩沖溶液中與肽在線衍生化后進(jìn)行HPLC-MS分析，結(jié)果表明，衍生化后的短鏈肽（7-15肽鏈）離子化能力有明顯增強，大大提高了其靈敏度（飛摩爾級），然而此衍生化試劑SPA在水溶液中極不穩(wěn)定，對操作要求較高，且無商品化產(chǎn)品，需要實驗室合成。Karin Gartenmann等[5]改進(jìn)了衍生化試劑，利用氨基保護(hù)試劑氯甲酸9-芴基甲酯（Fmoc）對多肽衍生化，簡便了操作步驟且提高了分析速度。

本研究擬采用FMOC衍生化方法，通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-ESI/MS）對煙草中的二肽進(jìn)行鑒定，并比較烤煙煙葉、白肋煙煙葉和香料煙煙葉中二肽種類及含量的差異，以期對香味風(fēng)格研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

分別選取2012年四川涼山烤煙云煙87、四川達(dá)州白肋煙達(dá)白1號和四川攀枝花香料煙三種不同類型調(diào)制后的煙葉進(jìn)行游離二肽分析，煙葉部位均為上二棚，等級均為B2F。各類型煙草栽培調(diào)制措施均按當(dāng)?shù)氐纳a(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。各煙葉于40℃干燥后研磨并過40目篩，備用。

甲醇、乙腈（色譜純，TEDIA）；0.1M硼酸鹽緩沖液（pH 10.4）、三氟乙酸（分析純，國藥）、丙酮、正戊烷、乙酸乙酯，氯甲酸9-芴基甲酯（Fmoc-Cl，分析純，Sigma公司）。雙丙氨肽（AA）標(biāo)樣（Sigma公司）。

4000 Q Trap質(zhì)譜儀（美國AB公司）；Waters Acquity超高壓液相色譜儀（UPLC，美國Waters公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore公司）；VX-200漩渦混合儀（美國Labnet公司）；2-16K高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；AL204-IC電子天平（0.1mg，梅特勒-托利多公司）。

1.2 雙丙氨肽（AA）標(biāo)樣處理與分析

準(zhǔn)確稱取10 mg雙丙氨肽標(biāo)樣于100 mL容量瓶中，以100 mL硼酸鹽緩沖液（0.1M，pH=10.4）溶解，定容，得到100 μg/mL雙丙氨肽標(biāo)準(zhǔn)溶液。

準(zhǔn)確量取1mL、5mL、10mL、50mL上述雙丙氨肽標(biāo)準(zhǔn)溶液于100mL容量瓶中，以100mL硼酸鹽緩沖液（0.1M，pH=10.4）溶解，最終分別得到1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL 和 100μg/mL的雙丙氨肽系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

參照文獻(xiàn)[3,6]方法，取500μL雙丙氨肽系列標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加入Fmoc-Cl衍生化試劑（500μL，5.8mM于丙酮中），劇烈攪拌反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物分別用2mL正戊烷/乙酸乙酯=80/20的溶劑萃取2次，合并水相進(jìn)行LC/MS分析。測定條件為：

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C-18柱（2.1 mm × 50 mm, 1.7μm）；柱溫：25℃；流動相：0.045%TFA/水溶液（A），0.05% TFA/80%乙腈水溶液（B）；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫：95%A+5%B（0～2 min），40%A+60%B（2～10 min），0%A（10～15 min），0%A（15～19 min），95%A+5%B（19～20 min）；進(jìn)樣量：10μL。

電離模式：電噴霧（ESI）正離子模式；電噴霧電壓：5500 V；檢測模式：全掃描；離子源溫度：500 ℃；Curtain Gas 50psi；Gas1 30psi；DP 30V；EP 5V；掃描時間：1s。

1.3 樣品處理與分析

稱取煙末約1g于25mL試管中，加入10 mL提取劑（30%甲醇/0.1%三氟乙酸），漩渦混合1 min后，在4℃下以15000 rpm離心15min。小心取出上層清液，通過0.22 μm濾膜，氮氣吹干，固形物使用2mL 5%乙酸銨溶液溶解，溶解液通過0.22 μm濾膜后保存于-18℃冰箱中備用。

將上述樣品溶液100 μL加入400 μL硼酸鹽緩沖液（0.1M，pH=10.4）中，然后再加入Fmoc-Cl衍生化試劑（500 μL，5.8 mM于丙酮中），劇烈攪拌反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物分別用2mL正戊烷/乙酸乙酯=80/20的溶劑萃取2次，合并水相進(jìn)行LC/MS分析。測定條件同1.2。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙葉中二肽的鑒定

HPLC及HPLC/MS常用于生物小分子肽的檢測[7-8]，為了提高小肽的穩(wěn)定性以及響應(yīng)，特別是提高其在LC-MS中的離子化效率，常利用FMOC衍生化的前處理辦法[3,9-10]。然而，由于二肽標(biāo)樣種類繁多，且大部分難以獲得，給定性定量帶來很大的困難。本研究根據(jù)Fmoc衍生肽的斷裂模式來鑒定煙草中的潛在游離二肽。Fmoc衍生二肽在MS/MS中的斷裂模式如圖1所示，主要斷裂如下：與Fmoc芳香部分的丟失相應(yīng)所產(chǎn)生的碎片離子m/z 179.2±0.1，m/z179的丟失產(chǎn)生了二肽質(zhì)量加上與Fmoc中O-C=O部分相應(yīng)的44的離子。所觀察到得其他斷裂是C-末端氨基酸的丟失，產(chǎn)生與N-末端氨基酸加上44質(zhì)量單位相應(yīng)的分子離子，由此揭示二肽的氨基酸序列。另外，同時發(fā)生的44質(zhì)量單位的丟失產(chǎn)生了二肽的分子離子，對于因為Lys或Tyr（分子中含兩個氨基或羥基）殘基的存在而攜帶附加Fmoc部分的肽而言，進(jìn)行了類似的斷裂模式觀察。

圖1 MS/MS中Fmoc衍生肽的斷裂模式Fig. 1 Fragmentation pattern of Fmoc-derivatized peptides in MS/MS analysis

以烤煙樣品質(zhì)譜圖為例（圖2）,從Fmoc衍生二肽的LC-MS總離子流圖（圖2a）上可以得到每個時間段的離子圖，全部未知質(zhì)量減去由Fmoc基團(tuán)引起的質(zhì)量單位222后，即為可能的二肽分子離子質(zhì)量。樣品在7.86min的主要分子離子為m/z383.2（圖2b），對應(yīng)二肽質(zhì)量數(shù)則為160.2。可能的二肽包括Ala-Ala、Gly-GABA以及GABA-Gly。對此分子離子進(jìn)行誘導(dǎo)斷裂，通過調(diào)節(jié)碰撞電壓，可以發(fā)現(xiàn)，主要的碎片離子為m/z 311.3（圖2c），這是Fmoc-氨基酸碎片離子，可以判斷與Fmoc端相連的氨基酸分子質(zhì)量為89，最有可能的即為丙氨酸Ala，由此可判斷7.86min的二肽為Ala-Ala二肽。經(jīng)與標(biāo)樣色譜圖及碎片離子比照，證實該峰為雙丙氨肽峰。

圖2 某烤煙樣品的總離子流圖（a）、母離子（b）和子離子（c）掃描圖Fig. 2 TIC chromatogram (a), parent (b) and product (c) ions of fl ue-cured tobacco sample by LC/MS

2.2 三種類型煙葉中二肽的組成及含量差異

根據(jù)Fmoc衍生肽的斷裂模式，分別對三種不同類型煙葉中的游離二肽進(jìn)行了鑒定，結(jié)果見表1-表3。實驗共鑒定出烤煙煙葉中14種二肽（表1），白肋煙煙葉中11種二肽（表2）以及香料煙煙葉中的9種二肽（表3）。但對于同量異序氨基酸，例如由Gln和Lys以及Ile和Leu組成的二肽，不能夠?qū)崿F(xiàn)N-或C-末端氨基酸清楚的鑒定。從表中可以看出，三種類型煙葉在二肽種類上既有相同組分，也存在著一定程度的差異。

試驗比較了不同類型煙葉游離二肽含量的差異，其中雙丙氨肽采用標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量，其他二肽采用與雙丙氨肽峰面積相對定量的方式。可以看出，煙葉中不同二肽含量范圍在1μg/g-120μg/g之間，谷氨酰胺（賴氨酸）-苯丙氨酸（KF/QF）以及雙丙氨肽（AA）在三種類型煙葉中均含量較大，烤煙中脯氨酰纈氨酸（PV）以及甘氨酰谷氨酰胺(賴氨酸)（GQ/GK）含量較高，白肋煙中天冬氨酰組氨酸（DH）含量較高，而香料煙中纈氨酰苯丙氨酸（VF/FV）以及谷氨酰谷氨酰胺（賴氨酸）（EK/KE）這兩種二肽含量較高。

研究表明[11]，白肋煙、馬里蘭煙、曬煙中含量最高的氨基酸為天門冬氨酸和谷氨酸，而烤煙和香料煙含量最高為脯氨酸和谷氨酸。不同類型煙草氨基酸含量在含量組成中脯氨酸、天門冬氨酸變異度最大?？梢钥闯觯煌愋蜔熑~中游離二肽的的組成及含量與氨基酸的差異是相一致的。

按照二肽在調(diào)制過程中對味覺影響[12]分類，烤煙中含量較高的脯氨酰纈氨酸（PV），其反應(yīng)香料具有愉悅的烘烤和面包氣息，白肋煙中含量較高的天冬氨酰組氨酸（DH），其反應(yīng)香料具有強烈的焦糖氣息，并伴有辛辣味；而香料煙中含量較高的谷氨酰谷氨酰胺（賴氨酸）（EK/KE），其反應(yīng)香料具有明顯的堅果和巧克力氣息，可以推測，以脯氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸為氨源的二肽對于不同類型煙草表現(xiàn)的內(nèi)在質(zhì)量有著一定影響。

表1 某烤煙煙葉中游離二肽的組成及含量Tab.1 Identi fi cation and characterization of dipeptides in fl ue-cured tobacco

表2 某白肋煙煙葉中游離二肽的組成及含量Tab.2 Identi fi cation and characterization of dipeptides in burley tobacco

表3 某香料煙煙葉中游離二肽的組成及含量Tab.3 Identi fi cation and characterization of dipeptides in oriental tobacco

由于目前國內(nèi)外對于煙草中肽的研究較少，不同類型的二肽對于煙草香氣、吃味等品質(zhì)的影響尚沒有明確的結(jié)論。但通過對煙草中二肽組成和含量的分析,能夠進(jìn)一步了解煙草品質(zhì)與內(nèi)在化學(xué)成分的關(guān)系，特別是對于小分子肽在調(diào)制、儲存以及燃吸過程中的反應(yīng)變化和香味貢獻(xiàn)研究，有一定的幫助。進(jìn)一步地，可以按照煙草內(nèi)源二肽組成，有的放矢地進(jìn)行二肽反應(yīng)香料研究，為煙草加香提供一種新的思路。

3 結(jié)論

（1）鑒定出烤煙煙葉中14種二肽，白肋煙煙葉中11種二肽以及香料煙中9種二肽。其在煙葉中的含量范圍為1μg/g-120μg/g。

（2）谷氨酰胺（賴氨酸）-苯丙氨酸（KF/QF）以及雙丙氨肽（AA）是三種類型煙葉中共有的含量較大組分，烤煙中脯氨酰纈氨酸（PV）以及甘氨酰谷氨酰胺(賴氨酸)（GQ/GK）含量較高，白肋煙中天冬氨酰組氨酸（DH）含量較高，而香料煙中纈氨酰苯丙氨酸（VF/FV）以及谷氨酰谷氨酰胺（賴氨酸）（EK/KE）這兩種二肽含量較高。

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Difference in composition and content of free dipeptides among various tobacco types

HE Qing1, ZHU Dongliang1, ZHANG Xiaoyu1, CHEN Kaibo1,2, TIAN Zhenfeng1,2
1 China Tobacco Anhui Industrial CO., LTD，Anhui Provincial Key Laboratory of Tobacco Chemistry, Hefei 230088, China；2 CTAH-USTC Associated Laboratory, Hefei 230088, China

In order to compare the differences in composition and content of free dipeptides among various tobacco types, free dipeptides in tobacco leaves were separated and analyzed by liquid chromatography coupled with mass spectrometry after methanol/TFA extraction and Fmoc derivatation. Test results showed that (1) 14 dipeptides in fl ue-cured tobacco, 11 in burley tobacco and 9 in oriental tobacco were identi fi ed through fragmentation mechanism discussion. Dipeptides content in tobacco was among 1μg/g-120μg/g. (2) Dipeptides of KF/QF and AA had high concentration in all tobacco types. Flue-cured tobacco samples had high dipeptides of PV and GQ/GK while burley samples were high in DH and oriental tobacco was high in VF/FV and EK/KE.

tobacco; peptides; LC-MS

何慶，朱棟梁，張曉宇,等. 不同類型煙葉中游離二肽的組成及含量差異分析[J]. 中國煙草學(xué)報，2015,21（4）

安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項目（20121001）

何慶（1986—），工程師，碩士，主要從事煙草及香料化學(xué)研究，Tel: 0551-65738672，Email: qing_he0421@163.com

田振峰（1975—），工程師，碩士，主要從事煙草及香料化學(xué)研究，Tel：0551-65738652，Email：Tianzfeng@sohu.com

2014-10-09

:HE Qing, ZHU Dongliang, ZHANG Xiaoyu, et al. Difference in composition and content of free dipeptides among various tobacco types [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(4)