覃 鋒張 力張春霞李杰輝劉秀娟

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530021)

簡易懸吊術(shù)制備兔與大鼠深靜脈血栓模型的研究

覃 鋒1張 力1張春霞1李杰輝1劉秀娟2

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530021)

目的：采用簡易懸吊術(shù)制備大鼠和家兔下肢深靜脈血栓模型，同時將大鼠模型和家兔模型做一比較，探討簡易懸吊術(shù)是否為一種簡便、適合動態(tài)研究深靜脈血栓的造模方法，大鼠和家兔哪一種動物更適合該造模方法。方法：選用36只體重為（250±20)g的SD大鼠和42只體重為（2.5±0.5）kg的清潔級家兔，家兔按隨機數(shù)字表法分為2組：動物模型組和假手術(shù)組。大鼠作為對照組。動物模型組及對照組均采用簡易懸吊術(shù)制備動物模型。造模后觀察不同時點動物模型血管內(nèi)膜及血栓不同時期的病理變化。大鼠模型和家兔模型做比較并與假手術(shù)組做觀察比較。結(jié)果：采用簡易懸吊術(shù)制作模型后，大鼠模型和家兔模模型動物下腔靜脈內(nèi)不僅均形成穩(wěn)定的血栓，而且形成血栓的動物存活率比較高，符合人體靜脈血栓形成急性期的病理演變。家兔模型比大鼠模型造模操作更簡單。結(jié)論：簡易懸吊術(shù)可以成功制作適合動態(tài)研究藥物對深靜脈血栓形成(DVT)作用機制的家兔或大鼠深靜脈血栓模型，家兔更適應(yīng)于該方法造模。

簡易懸吊術(shù)；大鼠；家兔；深靜脈血栓模型

適合的下肢深靜脈血栓形成(DVT)動物模型是動態(tài)研究藥物對深靜脈血栓形成(DVT)作用機制的關(guān)鍵。相關(guān)研究對動物模型要求較高，一要保證動物模型形成的血栓穩(wěn)定可靠，且符合人體靜脈血栓形成的病理學(xué)演變；二要保證動物模型成活率高，成活時間長。張惠明[1]在Reyers等[2]的大鼠下腔靜脈結(jié)扎法制備DVT模型基礎(chǔ)之上，以懸吊代替結(jié)扎，發(fā)明了一種新的下肢深靜脈血栓形成(DVT)動物模型的造模方式。為進一步明確該造模方法是否簡便，是否可重復(fù)，是否可以動態(tài)研究深靜脈血栓形成，是否適用于用家兔造模，特進行以下實驗：

1 材料及方法

1.1實驗動物

清潔級家兔42只，體重2.5±0.5kg，雌雄不限，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后，采用隨機數(shù)字表法分為2組：動物模型組36只，假手術(shù)組6只。

清潔級SD大鼠36只，體重250±20g，雌雄不限，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周。作為對照組。

1.2實驗方法

1.2.1造模

家兔動物模型組：以2%戊巴比妥鈉溶液，以1ml/1kg耳緣靜脈注射麻醉。先切開入腹，再打開后腹腔，游離腎靜脈與下腔靜脈匯合處及其下方 1.0cm長下腔靜脈段。在腎靜脈匯入下腔靜脈下方穿過一條“1”號絲線（圖1），引針將絲線兩端穿過腹壁，引出腹腔。同樣的方法在髂總靜脈上方置一懸吊線。將腸管及其系膜回納腹腔，調(diào)整懸吊線的位置以避免壓迫腸管。將兩條懸吊線打結(jié)分別固定在腹壁外，懸吊線的松緊度以其下可以穿過1支中華牌鉛筆為度（圖2）。生理鹽水10.0ml注入腹腔中，關(guān)腹。在進行預(yù)實驗時，發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)大一部分家兔腹部切口化膿感染，故在正式實驗時，在縫合皮膚前，在肌肉層和皮膚層之間常規(guī)撒阿莫西林藥粉0.025g，預(yù)防感染。

假手術(shù)組：6只家兔僅游離腎靜脈與下腔靜脈匯合處及其下方1.0 cm長下腔靜脈段，并在相應(yīng)部位穿過“1”號絲線后即關(guān)腹，其余同動物模型組。

大鼠對照組：操作方法與家兔組基本相同，不同之處如下：①麻醉采用2%戊巴比妥鈉溶液1ml/100g腹腔注射麻醉；②關(guān)腹前，注入腹腔生理鹽水2.0ml；③縫合皮膚前，不在皮膚層和肌肉層之間撒阿莫西林藥粉。

1.2.2標(biāo)本采取及制備

制模成功后，采用隨機數(shù)字表法按術(shù)后6h和1、3、7、10、14d不同時點各取6只造模家兔及大鼠，分別抽取家兔及大鼠靜脈血，量記抽血量。抽血后，前法麻醉后開腹，取出結(jié)扎線下方下腔靜脈段血管，量記血栓長度，血管以生理鹽水漂洗，10%甲醛固定。脫水后石蠟包埋、切片，行HE染色，在200倍光鏡下觀察并攝片。同法按術(shù)后6 h和1、3、7、10、14d不同時點各取1只假手術(shù)組家兔下腔靜脈段血管并同樣處理。

2 結(jié)果

2.1兩模型組操作過程比較

造模過程中，最難之處就是游離下腔靜脈，因為動靜脈往往伴行，有時甚至是緊貼在一起。操作時，不僅要將靜脈完整游離，不使動靜脈破裂出血，而且要保證靜脈不受到過多干擾，否則產(chǎn)生的血栓是由于懸吊形成的呢，還是由于造模過程中損傷了血管內(nèi)膜，由此導(dǎo)致的血栓形成，導(dǎo)致疑問。在髂總靜脈和腎靜脈與下腔靜脈匯合處之間，大鼠的動靜脈連接異常緊密，要想完整分離，并做到不對靜脈造成過多干擾，需要耗費較多時間和精力。而家兔對應(yīng)段動靜脈間間隙相對較松，可以相對輕松地在不對靜脈造成過多干擾的情況下完成靜脈游離。

2.2存活情況比較

家兔動物模型組在術(shù)后第3d和第4d分別死亡1只，存活率 94.44%；假手術(shù)組存活率 100%。大鼠動物模型無大鼠死亡，存活率100%。

存活率比較：大鼠模型組存活率100%，家兔模型組存活率97.22%，兩者經(jīng)卡方檢驗，X2=0.5143，P>0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3肉眼觀察

家兔動物模型組：制模阻斷下腔靜脈6h后，可見兩條原懸吊線間下腔靜脈段血管壁彈性下降。剖開血管可見已形成的黑色血栓。術(shù)后6h家兔的后肢與腰臀部出現(xiàn)腫脹，隨著時間推移，未見明顯加重，于血栓形成后第4d逐漸緩解，活動增加、食欲改善。血栓形成后第14d，后肢與腰臀部仍有輕度腫脹。腹腔內(nèi)均可見腸系膜靜脈血管明顯擴張。

大鼠動物模型組：血栓形成與演變與家兔動物模型組相似，只是大鼠動物模型組飲食、精神狀態(tài)和活動較家兔動物模型組要佳，后肢與腰臀部腫脹消退相對稍快。

記錄血栓形成的各組動物數(shù)量。其中家兔動物模型組和大鼠動物模型組血栓形成率均為100%。假手術(shù)組未見血栓形成。

量記血栓長度，血栓長度見表1。

表1　血栓長度(±S)

表1　血栓長度(±S)

注：兩組比較，P<0.01，有顯著差異。

組別 　例數(shù) 　血栓長度（mm）家兔動物模型組 　34 　16±5.43大鼠動物模型組 　36 　8±2.85

2.4鏡下觀察

無論是大鼠組還是家兔組，其血管切片在光鏡下觀察，所見大致相同：

假手術(shù)組：血管內(nèi)膜表面平整，內(nèi)皮細(xì)胞大小均勻、排列整齊，管腔內(nèi)無血栓。血栓靜脈周圍小血管無擴張，未見明顯炎細(xì)胞浸潤（圖3）。

動物模型組：①術(shù)后6h，靜脈管腔可見血栓堵塞，血管內(nèi)膜斷裂、不規(guī)整，內(nèi)膜下層裸露。②術(shù)后第1d，靜脈管腔基本被血栓堵塞，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷脫落，血栓靜脈周圍小血管擴張并見炎細(xì)胞浸潤。血栓邊緣可見珊瑚狀血小板梁，中央纖維蛋白網(wǎng)束間有大量的紅細(xì)胞和少量的白細(xì)胞，為混合血栓表現(xiàn)。血栓未見機化現(xiàn)象。③術(shù)后第3d，血栓靜脈周圍炎細(xì)胞增多，小血管擴張明顯。血栓開始出現(xiàn)機化現(xiàn)象，可見個別纖維母細(xì)胞從血管壁進入血栓邊緣，但未見新生毛細(xì)血管。④術(shù)后第7d，血栓機化表現(xiàn)明顯，有肉芽組織生長，纖維母細(xì)胞數(shù)量增多但形態(tài)較幼稚。血栓中央可見大量的中性粒細(xì)胞浸潤（圖 4）。⑤術(shù)后第 10d，血栓機化明顯，可見增生的肉芽組織長入血栓內(nèi)部，纖維母細(xì)胞形態(tài)趨于成熟，新生毛細(xì)血管數(shù)量增多，血栓中中性粒細(xì)胞數(shù)量減少。⑥術(shù)后第14d，鏡下可見機化組織向內(nèi)部深入，替代了血栓部分，血栓內(nèi)中性粒細(xì)胞已很少見，炎細(xì)胞以淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為主。對照組均可形成穩(wěn)定的血栓，其血栓演變規(guī)律與模型組類似。

2.5采血成功率及量

無論是大鼠組還是家兔組，均由有經(jīng)驗的護士耳部采血，成功率均為100%，但家兔靜脈穿刺采血明顯較大鼠靜脈穿刺采血為易。

每只動物盡可能抽取血量，量記采血量，采血量見表2。

表2　采血量(±S)

表2　采血量(±S)

注：兩組比較，P<0.01，有顯著差異。

組別 　例數(shù) 　采血量（ml）家兔動物模型組 　34 　10±3.58大鼠動物模型組 　36 　6±2.65

3 討論

DVT是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病，要更好防治，除臨床研究外，實驗研究也需加強，因此建立DVT動物模型就十分重要。如何以簡易的方法建立一個穩(wěn)定、價格低廉并符合血栓動態(tài)變化的實用DVT動物模型呢？

查閱資料，在研究藥物在體內(nèi)抑制血栓形成的作用及機制時，以Reyers等[2]建立的大鼠下腔靜脈結(jié)扎法DVT模型應(yīng)用最為廣泛。其基本原理是以靜脈結(jié)扎方式阻斷下腔靜脈，使局部血流淤滯、缺氧，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，瀑布式凝血系統(tǒng)啟動，致使血栓形成。一般在靜脈結(jié)扎6h后血栓形成率為100%。然而其建立的大鼠下腔靜脈結(jié)扎法 DVT模型雖然可以形成穩(wěn)定的混合血栓，但是仍有諸多缺點[3]，尤其是難于體現(xiàn)血栓動態(tài)變化。

張惠明、張力[1]對 Reyers的造模方法加以改良，發(fā)明了簡易懸吊術(shù)，避免了因術(shù)后下腔靜脈結(jié)扎處粘連而難以抽出的情況，以懸吊方法將下腔靜脈實驗段血管上、下阻斷并放置6h，使所形成的血栓停滯在原懸吊線之間。此時，原懸吊處下腔靜脈各屬支血流緩慢，局部血流淤滯、缺氧，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞變性，細(xì)胞間連接破壞。血液中多核白細(xì)胞黏附受損的內(nèi)皮，產(chǎn)生多種促凝因子，血小板聚集，加速血栓形成[4]。從而在術(shù)后各時點動物模型組中均可形成穩(wěn)定的血栓。當(dāng)靜脈內(nèi)形成的血栓較多較大、不能及時被完全吸收時，血栓部位的血管壁可生長出肉芽組織進入血栓內(nèi)，將血栓逐漸機化、替代[5]。血栓形成后第3d左右開始機化，2～4周已完全機化并形成腔隙。

臨床上，全身主干靜脈均可發(fā)生DVT，但多見于下肢。據(jù)報道左下肢更易發(fā)生 DVT[6]。但由于大鼠股靜脈較細(xì)，股動、靜脈粘連緊密，選擇大鼠股靜脈很難成功造模，故多選用下腔靜脈替代股靜脈作為首選造模血管[7]。觀察本實驗術(shù)后6h和1、3、7、10、14 d不同時點的動物模型組病理演變過程，無論是家兔動物模型還是大鼠動物模型均符合人體下肢靜脈血栓形成急性期病理演變[2]。完全可以用于動態(tài)研究藥物對深靜脈血栓形成(DVT)作用機制。

本研究采用簡易懸吊術(shù)，以大鼠、家兔為實驗動物制備深靜脈血栓模型，結(jié)果顯示大鼠、家兔動物模型下腔靜脈內(nèi)均可形成穩(wěn)定的血栓，成功率高，均符合人體下肢靜脈血栓形成急性期病理演變特點。形成血栓的動物模型中，無論大鼠、家兔的存活率均較高，能滿足實驗要求，兩者無顯著性差異。將大鼠模型和家兔模型做一比較，家兔模型有如下優(yōu)勢：①造模操作相對容易：在造模過程中，大鼠的動靜脈連接異常緊密，操作相對困難，血栓形成后大鼠下肢腫脹度持續(xù)時間較長。家兔對應(yīng)段動靜脈間間隙相對較松，實驗操作相對容易。因此家兔模型比大鼠模型操作更簡單，更適用。②家兔模型形成的血栓長度明顯較大鼠模型長，易于采集。③家兔模型血液的抽取更容易，血量明顯多于大鼠模型。

總之，簡易懸吊術(shù)可以成功制作適合動態(tài)研究藥物對深靜脈血栓形成(DVT)作用機制的的家兔或大鼠深靜脈血栓模型，家兔更適應(yīng)于該方法造模。

圖1　懸吊下腔靜脈

圖2　懸吊松緊判斷

圖3　HE染色×100

圖4　HE染色×100

[1] 張惠明,張力.簡易懸吊術(shù)制備大鼠深靜脈血栓模型[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,18(17):1979-1989.

[2] Reyers I,Mussoni L,Donati MB,et al. Failure of aspirin at different doses to modify experimental thrombosis in rats[J].ThrombRes,1980,18(5):669.

[3] 賽力克·馬高維亞,王護國,羅軍,等.一種適合動態(tài)研究的大鼠深靜脈血栓動物模型[J].中國普外基礎(chǔ)于臨床雜志,2008,15(6):408-411.

[4] 陸慰萱,劉春萍.深靜脈血栓形成和肺血栓栓塞癥的自然病程[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2003,83(1):84.

[5] 高峰,胡建國,關(guān)薇薇.SD大鼠深靜脈血栓模型的建立及其靜脈壁形態(tài)學(xué)研究[J].江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2008,48(2):25.

[6] 李曉強,桑宏飛.下肢深靜脈血栓形成的外科治療[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2006,13(6):638.

[7] 劉政,侯玉芬,周濤.深靜脈血栓形成動物模型的建立及應(yīng)用進展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2005,11(5):451.

Research summary simple suspension for preparation of rabbit and rat model of deep vein thrombosis

Objective: Using simple suspension for preparation of rabbit and rat model of deep vein thrombosis. At the same time, compared the model rats with rabbits ,explore simple suspension is a kind of simple and suitable for dynamic study of deep vein thrombosis (DVT) modeling method, rats and rabbits which animals is more suitable for the modeling method. Methods: Selection of 36 weighing (250±20) grams of SD rats and 42 weighing (2.5±0.5)grams of cleaning stage rabbits .The rabbits were divided into animal model group and sham operation group with random digits table method. Rats served as control group. The animal model group and the control group were prepared by simple suspension operation. To observe the pathological changes of the vascular intima and blood clots in different time points after model prepared. The rat model and the rabbit model compare observed and compared with sham operation group do. Results: After preparing model using simple suspension, not only did rat model and rabbit model animal inferior vena venous formed stable thrombus, but also the formation of thrombosis animal survival rate was relatively high, in line with the human vein thrombosis in acute stage of pathological evolution. The rabbit model is more simple than rat model. Conclusion: Simple suspension can be successful for the production dynamics of drugs on the formation of deep venous thrombosis (DVT) mechanism in the rabbit or rat deep vein thrombosis model, rabbit is more suitable to the method of modeling.

Simple and easy ventrofixation;rabbit;rats;deep vein thrombosis

R-33

A

1008-1151(2015)07-0081-03

2015-06-10

廣西自然科學(xué)基金（桂科自0991167）。

覃鋒（1984－），女，廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院主治醫(yī)師，中醫(yī)外科學(xué)碩士，從事周圍血管疾病的診療。

張力（1964－），男，湖南醴陵人，廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院主任醫(yī)師，從事周圍血管疾病的中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合診療及基礎(chǔ)研究。