吾布力·沙地克，買買提·熱合曼，依明·蘇來曼

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2．新疆輪臺縣畜牧獸醫(yī)站）

輪臺土種絨山羊KIF-I基因第1、3外顯子的多態(tài)性分析

吾布力·沙地克1，買買提·熱合曼2，依明·蘇來曼1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2．新疆輪臺縣畜牧獸醫(yī)站）

研究以輪臺土種絨山羊?yàn)檠芯繉ο?，利用Primer 5.0軟件設(shè)計出1對引物,以成年山羊基因組DNA為模板,擴(kuò)增山羊的KIF-I基因，采用PCR-SSCP技術(shù)研究輪臺絨山羊KIF-I基因外顯子1、3的基因多態(tài)性。結(jié)果表明：①KIF-I基因外顯子1存在兩種基因型：AA型、AB型；AA基因型頻率0.36，AB基因型頻率0.64。其中A等位基因頻率0.82，B等位基因頻率0.18。基因純合度0.705，基因雜合度0.295。②KIF-I基因外顯子3在輪臺土種絨山羊品種上未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。

輪臺絨山羊；PCR-SSCP；KIF-I基因；遺傳多態(tài)性

新疆山羊是分布于新疆全境，絨、肉、乳、皮兼用的原始地方品種。該品種山羊絨纖維具有纖細(xì)柔軟、強(qiáng)絲光、強(qiáng)力大、凈絨率高等特點(diǎn)，對于發(fā)展細(xì)絨型山羊有著重要意義。但該山羊存在體格小、成熟較晚、生長發(fā)育緩慢、產(chǎn)絨量低等不足，嚴(yán)重阻礙了新疆山羊產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。國內(nèi)外對絨山羊絨毛性狀遺傳參數(shù)的研究以及有關(guān)營養(yǎng)水平、微量元素、光照、褪黑激素、季節(jié)性生長模式等對絨毛性狀和品質(zhì)影響的研究報道較多，但絨山羊飼養(yǎng)者往往只注重產(chǎn)絨量的提高，而忽視絨毛品質(zhì)和產(chǎn)量的變化規(guī)律，致使絨山羊飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)效益低，群體產(chǎn)絨潛力得不到充分發(fā)揮。努力提高山羊的產(chǎn)絨量和羊絨品質(zhì)，是近年來絨山羊培育的主要方向。

當(dāng)前分子遺傳學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，為家畜品種資源多樣性的研究和保護(hù)提供了良好的契機(jī)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在山羊遺傳多樣性研究中發(fā)揮著重要作用。由于羊毛纖維本身具有高度的組織結(jié)構(gòu)，其中纖維的90%是由角蛋白中間絲（keratin intermediate filament，KIF）和角蛋白輔助蛋白（keratin-associated protein，KAP）構(gòu)成。KIF蛋白有2個家族，即KIF-Ⅰ酸性（keratin intermediate filament typeⅠ）和KIF-Ⅱ堿性（keratin intermediate filament typeⅡ）角蛋白。綿羊的KIF-Ⅰ和KIF-Ⅱ基因分別位于染色體11q25～q29和染色體3q14～q22，其中KIF-Ⅰ基因長4～5 kb，包含6個內(nèi)含子；KIF-Ⅱ基因長7～9 kb，包含8個內(nèi)含子。在羊毛發(fā)育過程中，等量的酸性（Ⅰ型）和堿性（Ⅱ型）角蛋白配對形成8～10 nm的細(xì)絲，填充在KAP的基質(zhì)之間。目前，國內(nèi)外對產(chǎn)絨性能的相關(guān)性研究主要集中在KAP基因方面，而以新疆（絨）山羊?yàn)檠芯繉ο?，以KIF基因?yàn)楹蜻x基因的研究報道較少。本研究對輪臺絨山羊KIF-I基因外顯子1、3的多態(tài)性及其與產(chǎn)絨性狀的關(guān)系進(jìn)行研究，以期為綿（絨）山羊的育種提供一定的遺傳學(xué)理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本的采集選擇新疆輪臺縣健康無病的山羊100只作為試驗(yàn)材料。采集山羊頸部靜脈血樣5～8 mL，EDTA-K2抗凝，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-20℃長期凍存。

1.1.2主要藥品和試劑Taq DNA聚合酶，上下引物，dNTPs，Marker，Tris飽和酚，6×Loading Buffer，10×PCR Buffer，三氯甲烷，EDTA，NaCl，Tris·HCl，SDS，無水乙醇，溴化乙錠，硼酸，二甲苯氰，過硫酸銨，溴酚藍(lán)，瓊脂糖，變性劑，聚丙烯酰胺，染色液，超純水。

1.2.3主要試驗(yàn)儀器Eppendorf移液器，超凈工作臺，BIOFUGE PRIMOR型低溫離心機(jī)，JY04S型凝膠成像儀，Mini-6K型微型離心機(jī)，PCR儀（050-810 Tgradient48型），DYCP-31CN型瓊脂糖水平電泳槽。

1.2方法

1.2.1血液基因組DNA的提取 采用常規(guī)的酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于TE中，-20℃保存；用1.2%～1.5%的瓊脂糖檢測提取的基因組DNA的效果并估算其濃度。

1.2.2引物設(shè)計及PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank上的絨山羊基因序列（登錄號：GQ-988385）設(shè)計一對特異性引物，由上海生工生物工程公司合成，引物序列、大小等見表1。PCR反應(yīng)體系 20 μL，上下游引物各 0.6μL，模板DNA1.5 μL，PCR Green Mixture10 μL，加超純水至20 μL；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s，經(jīng)過30次循環(huán)，72℃延伸5 min后，4℃保存。

表1　KIF-Ⅰ基因外顯子1、3引物序列

1.2.3利用PCR-SSCP分析多態(tài)性PCR產(chǎn)物的SSCP分析方法參考王旭等的方法進(jìn)行。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，若出現(xiàn)特異性條帶，且條帶清晰、大小和質(zhì)量符合要求，則用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，經(jīng)銀染法脫色、顯色液顯色，最后用凝膠成像系統(tǒng)成像。

2　結(jié)果與分析

2.1基因組DNA提取結(jié)果

基因組DNA提取結(jié)果見圖1?？梢奃NA條帶清晰明亮，純度好，適宜進(jìn)行相關(guān)的PCR擴(kuò)增。

圖1　輪臺絨山羊血液基因組1%瓊脂糖檢測結(jié)果

2.2KIF-Ⅰ基因外顯子1的群體遺傳變異分析

2.2.1KIF-Ⅰ基因外顯子1的PCR產(chǎn)物檢測對輪臺絨山羊KIF-Ⅰ基因外顯子1的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果用2%瓊脂糖檢測（圖2）。結(jié)果顯示，KIF-Ⅰ基因外顯子1的片段長度為251 bp，與預(yù)期大小相符。

圖2　輪臺絨山羊外顯子1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3KIF-Ⅰ基因外顯子1的PCR-SSCP結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到2種（AA，AB）基因型（圖3）。其中第1、2、3、5、6、7、10泳道為AB型，第4、8、9泳道為AA型。

圖3　輪臺絨山羊PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2.2KIF-Ⅰ基因外顯子1的序列分析根據(jù)PCR-SSCP分析結(jié)果，選取2種基因型的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測序。將測序結(jié)果與山羊KIF-Ⅰ基因序列（GenBank登錄號：GQ-988385）進(jìn)行比較（圖4）。測序結(jié)果表明，輪臺絨山羊KIF-Ⅰ基因外顯子1片段長度為251 bp，分析序列個體數(shù)為10，對測序的DNA序列用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比較后發(fā)現(xiàn)，在KIF-Ⅰ基因外顯子1上DNA序列的第429位點(diǎn)出現(xiàn)了C→A變異（圖5）。

圖4　輪臺絨山羊外顯子1引物擴(kuò)增片段的核苷酸序列同源性比較

圖5　不同基因型測序結(jié)果

2.2.3KIF-Ⅰ基因外顯子1型頻率和等位基因頻率及遺傳特性 在所檢測的輪臺絨山羊群體中，KIF-Ⅰ基因外顯子1的AA、AB兩種基因型的頻率分別為0.64和0.36。等位基因A、B的頻率分別為0.82和0.18。KIF-Ⅰ基因的引物擴(kuò)增產(chǎn)物在輪臺絨山羊處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P<0.05）。

根據(jù)電泳結(jié)果，計算輪臺土種絨山羊KIF-Ⅰ基因外顯子1的基因純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量。結(jié)果表明，輪臺絨山羊基因外顯子1的基因純合度為0.705，基因雜合度為0.295，有效等位基因數(shù)1.419，多態(tài)信息含量（PIC）0.252。根據(jù)確定位點(diǎn)多態(tài)性的標(biāo)準(zhǔn)，輪臺絨山羊KIF-I基因多態(tài)位點(diǎn)屬于中度多態(tài)（0.25

2.3KIF-Ⅰ基因外顯子3的群體遺傳變異分析

2.3.1PCR擴(kuò)增結(jié)果 提取的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖6為KIF-1基因外顯子3的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增片段長度與所預(yù)測的片段長度一致。

圖6　輪臺絨山羊外顯子3 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3.2KIF-Ⅰ外顯子3基因PCR-SSCP分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，未發(fā)現(xiàn)存在任何變異位點(diǎn)。

2.3.3KIF-Ⅰ基因外顯子3不同基因型序列分析根據(jù)SSCP結(jié)果選出8個KIF-Ⅰ外顯子3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測序。測序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列快速分析。結(jié)果顯示，8個樣品的測序結(jié)果都一樣，沒有堿基突變、缺失等現(xiàn)象。KIF-Ⅰ基因外顯子3只存在一種基因型（AA），沒有多態(tài)性。根據(jù)設(shè)計引物的原序列（GenBank序列號為Ga988385）與KIF-Ⅰ基因外顯子3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行對比，證實(shí)PCR產(chǎn)物測序后的序列與原序列一樣，沒有突變。

3　討論

3.1山羊KIF-Ⅰ基因外顯子1群體遺傳變異

方光新等[1]從群體遺傳學(xué)角度分析統(tǒng)計了3個山羊群體在KIF-I-P1酶切位點(diǎn)基因型、等位基因頻率。在3個山羊群體中，A為優(yōu)勢等位基因，在新疆山羊、南疆絨山羊、博格達(dá)白絨山羊中的頻率分別為0.700、0.729、0.747；AA型為優(yōu)勢基因型，在新疆山羊、南疆絨山羊、博格達(dá)白絨山羊中的頻率分別為0.505、0.506、0.562。外顯子1上T>C的突變?yōu)殄e義突變，引起氨基酸C→R的變化。T.O.Itenge-Mweza等使用PCR-SSCP技術(shù)在美利奴羊上做過類似的研究，得到5種基因型，發(fā)現(xiàn)3處突變。

本研究所檢測的輪臺絨山羊群體中，KIF-Ⅰ基因第1外顯子的AA、AB兩種基因型的頻率分別為0.64和0.36，等位基因A、B的頻率分別為0.82和0.18。本研究結(jié)果與其他人的結(jié)果不一致。

3.2山羊KIF-Ⅰ基因外顯子3群體遺傳變異

方光新等[1]利用KIF-1基因家族對新疆3個地方山羊品種進(jìn)行研究，結(jié)果表明：KIF-1基因外顯子3處3212位存在C→T的突變，減少一個HaeIII酶切位點(diǎn)，檢測到AA、AB、BB三種基因型，A為優(yōu)勢等位基因，在新疆絨山羊、南疆絨山羊、博格達(dá)白絨山羊中的頻率分別為0.823、0.777、0.883。此突變沒有引起氨基酸的變化，為同義突變。

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S827.2

A

2095-3887（2015）02-0005-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.02.002

2014-12-10

吾布力·沙地克（1956-），男，維吾爾族，副教授，碩士生導(dǎo)師。

依明·蘇來曼，男，維吾爾族，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：動物遺傳育種。