方佳萍，趙秀娟，齊艷，王璽，吳旭東△，婁建石

利用CRISPR/Cas9n系統(tǒng)構(gòu)建Asxl2基因敲除的NIH3T3穩(wěn)定細胞系

方佳萍1,2，趙秀娟3，齊艷4，王璽3，吳旭東3△，婁建石1△

目的利用CRISPR/Cas9n系統(tǒng)在NIH3T3小鼠胚胎成纖維細胞系中敲除Asxl2基因。方法設(shè)計一對靶向小鼠Asxl2基因第5個外顯子的小向?qū)NA（sgRNA），分別克隆進pX462載體。將測序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NIH3T3細胞中，利用有限稀釋法得到單細胞，通過培養(yǎng)獲得單克隆細胞系。提取單克隆細胞系基因組DNA，ge?notyping PCR擴增出靶位點附近的DNA片段并測序。利用Western blot方法檢測細胞株中Asxl2的敲除效果。結(jié)果成功構(gòu)建靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重組質(zhì)粒。將2個重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，嘌呤霉素篩選后得到亞克隆細胞系，并且經(jīng)genotyping PCR測序驗證得到一株正確的單克隆細胞系。Western blot證實敲除Asxl2后，該NIH3T3細胞系中Asxl2蛋白表達缺失。結(jié)論通過這個系統(tǒng)得到了靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重組質(zhì)粒及穩(wěn)定敲除Asxl2的NIH3T3細胞系。

ASXL2；CRISPR/Cas9n；CRISPR系統(tǒng)；表觀遺傳

果蠅Asx（Additional sex combs）基因最初是通過PcG（Polycomb group）樣的突變表型和與PcG基因的相互作用被鑒定出來的［1-2］，是ETP（Enhancers of trithorax and Polycomb）基因的一種［3］，能調(diào)節(jié)或招募Polycomb抑制復(fù)合體（Polycomb-group repressor complex，PRC）和trithorax激活復(fù)合體（trithoraxgroup activator complex），在不同的狀態(tài)下起到調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制的雙重作用［4-6］。果蠅Asx基因

在哺乳動物中有3個同源基因，分別為Asxl1、Asxl2和Asxl3，其中Asxl2基因在2003年由Katoh等［7］鑒定出來。本研究利用CRISPR（Clustered regularly in?terspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR-associated）9n系統(tǒng)建立Asxl2基因靶向敲除系統(tǒng)，并獲得Asxl2基因穩(wěn)定敲除的NIH3T3小鼠胚胎成纖維細胞系，以期為進一步研究Asxl2基因的功能及作用機制提供細胞模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及細胞CRISPR/Cas9n質(zhì)粒pSpCas9n（BB）-2A-Puro（pX462）及NIH3T3細胞由本實驗室保存。感受態(tài)細菌trans5α購自北京全式金公司。質(zhì)粒圖譜可于http:// www.addgene.org網(wǎng)站查詢。

1.1.2 酶類及主要試劑Fast Digest BbsⅠ、FastAP、10×Fast Digest Buffer（Green）購自Fermentas公司；T4 PNK、T4 ligase、10×T4 Ligation Buffer、10 mmol/L ATP購自NEB公司；Plas?mid Safe exonuclease、10×Plasmid Safe Buffer購自Epicentre公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司；質(zhì)粒大量提取試劑盒購自QIAGEN公司；Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；Opti-MEM培養(yǎng)基購自Gbico公司；兔源Asxl2抗體由丹麥Biotech Research and Innovation Centre的Kristian Helin教授饋贈；鼠源β-actin抗體、辣根過氧化物酶標抗鼠IgG購自CST公司。

1.1.3 其他基因測序工作由華大科技公司完成。小向?qū)NA（sgRNA）寡鏈核苷酸（oligo）DNA序列由蘇州金唯智生物科技有限公司北京分公司合成。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA oligo序列的設(shè)計應(yīng)用http：//crispr.mit.edu/網(wǎng)站設(shè)計一對針對Asxl2 cds區(qū)第5個外顯子的sgRNA序列，見圖1。設(shè)計方法如下：（1）根據(jù)NCBI發(fā)布的mAsxl2 cds區(qū)序列，在起始密碼子后面尋找大約200 bp富含NGG的序列，提交至該網(wǎng)站。（2）根據(jù)網(wǎng)站提交的結(jié)果，選擇分數(shù)較高的一對序列，在其兩端加上酶切位點。在每條sgRNA序列F鏈的5′端添加CACC，R鏈的5′端添加AAAC，與pX462質(zhì)粒經(jīng)Fast Digest BbsⅠ酶切后形成的黏性末端互補。如F鏈的5′端第一個堿基不是G，則在5′端CACC后面添加一個G，相應(yīng)地R鏈的3′端再增加一個C，見表1。以下將2個pX462重組質(zhì)粒分別稱為pX462-Asxl2-1和pX462-Asxl2-2。

Tab.1The sequences of mAsxl2 sgRNA oligo表1 mAsxl2 sgRNA oligo序列

在oligo序列兩端添加的堿基用加粗斜體并下劃線表示

1.2.2 重組質(zhì)粒pX462-Asxl2-1和pX462-Asxl2-2的構(gòu)建與鑒定pX462為含U6啟動子的sgRNA骨架表達載體，表達具有Cas9 D10A切口酶突變的Cas9n，帶有氨芐青霉素和嘌呤霉素抗性。用Fast Digest BbsⅠ對pX462進行酶切，DNA凝膠電泳后回收線性化的載體。用T4 PNK分別對oligo1、oligo2進行磷酸化和退火。用T4 ligase將線性的pX462質(zhì)粒載體分別與退火后的oligo1、oligo2室溫連接1 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌trans5α，在氨芐抗性的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆搖菌，送測序。測序引物為U6啟動子的正向引物序列，5′-ATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATA-3′。測序正確的克隆提取重組質(zhì)粒pX462-Asxl2-1和pX462-Asxl2-2。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染和單克隆細胞的獲得將Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑和Opti-MEM混合，重組質(zhì)粒pX462-Asxl2-1和pX462-Asxl2-2分別與Opti-MEM混合，室溫孵育5 min。再將Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑混合物與重組質(zhì)?；旌衔锘旌希覝胤跤?0 min。消化NIH3T3細胞，按一定密度接種于6孔板中，加入孵育完的轉(zhuǎn)染試劑、重組質(zhì)粒混合物。轉(zhuǎn)染8 h后換液，48 h后加入嘌呤霉素篩選。篩選48 h后消化細胞，用有限稀釋法將細胞按一定密度接種于96孔板中，獲得單細胞。

1.2.4 單克隆細胞系genotyping PCR測序鑒定培養(yǎng)1周后，將單克隆細胞接種到24孔板，得到8株單克隆細胞系。其中5#和8#生長狀態(tài)比較好，分別命名為Asxl2 ko（knock out）5#和Asxl2 ko 8#。培養(yǎng)1周左右收集細胞，提取基因組DNA，在重組質(zhì)粒pX462-Asxl2-1和pX462-Asxl2-2靶向的位點上、下游設(shè)計引物，見表2，進行PCR，PCR產(chǎn)物DNA凝膠電泳后回收，送測序。

Tab.2The sequences of mAsxl2 genotyping PCR and RT-qPCR primer表2 mAsxl2 genotyping PCR及RT-qPCR引物序列

1.2.5 Western blot檢測Asxl2的表達收集野生型NIH3T3細胞和測序正確的單克隆細胞，用RIPA裂解細胞，收集全細胞提取物，離心取上清作為樣品，用野生型的NIH3T3細胞的細胞裂解液作對照。測定樣品蛋白濃度，取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)濕轉(zhuǎn)印至NC膜后，5%脫脂牛奶封閉，一抗、二抗孵育，加入曝光底物進行曝光。以β-actin為內(nèi)參，Western blot法檢測Asxl2蛋白在細胞中的表達情況，比較野生型細胞和Asxl2敲除細胞中Asxl2蛋白的表達差異。

1.2.6 RT-qPCR檢測Asxl2的表達收集野生型NIH3T3細胞和測序正確的單克隆細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，去除基因組DNA，再逆轉(zhuǎn)cDNA。設(shè)計Asxl2 RT-qPCR引物，見表2，進行RT-qPCR。rpo作為內(nèi)參，檢測Asxl2在細胞中的表達情況，比較野生型細胞和Asxl2敲除細胞中Asxl2的表達差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pX462-Asxl2-1和pX462-Asxl2-2的測序重組質(zhì)?；驕y序結(jié)果顯示，在酶切位點之間插入的片段位置、方向及序列與預(yù)期一致，證實oligo1、oligo2正確插入pX462，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 單克隆細胞株genotyping PCR片段測序的結(jié)果將Asxl2 ko 5#和Asxl2 ko 8#的測序結(jié)果與mAsxl2的全基因組序列比對，發(fā)現(xiàn)Asxl2 ko 5#的靶位點附近發(fā)生了缺失，并且在靶位點的下游發(fā)生了很多點突變，見圖2。Asxl2 ko 5#測序結(jié)果的峰圖顯示，靶位點附近有雜峰，見圖3A。因此Asxl2 ko 5#的靶位點附近沒有發(fā)生有意義的插入或缺失突變。Asxl2 ko 8#在靶位點處插入了一段片段，見圖2。Asxl2 ko 8#測序結(jié)果的峰圖顯示，靶位點附近均為單一峰，測序結(jié)果良好，見圖3B，Asxl2 ko 8#在靶位點上成功引入插入突變。

2.3 Western blot檢測Asxl2蛋白敲除的效果相比于野生型NIH3T3細胞，Asxl2 ko 5#單克隆細胞內(nèi)源性Asxl2蛋白表達量下降，但仍有表達。Asxl2 ko 8#單克隆細胞內(nèi)源性Asxl2蛋白幾乎完全沒有表達，與測序結(jié)果一致，見圖4。

Fig.4Western blot analysis of Asxl2圖4 Western blot檢測Asxl2蛋白表達水平結(jié)果

2.4 RT-qPCR檢測Asxl2基因表達的變化相比于野生型NIH3T3細胞，Asxl2 ko 8#單克隆細胞Asxl2基因表達降低（1.000±0.034 vs 0.377±0.008，t= 31.031，P＜0.01）。

3 討論

3.1 CRISPR/Cas9n技術(shù)基因打靶技術(shù)是一種重要的分子技術(shù)研究手段。CRISPR/Cas9n系統(tǒng)是新一代的基因定向編輯技術(shù)，相比于鋅指核酸內(nèi)切酶（zinc finger endonuclease，ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nu?clease，TALEN）等經(jīng)典的基因打靶技術(shù)，具有操作簡單、制備周期短、精確高效等優(yōu)點［8］。自該技術(shù)報道以來，CRISPR/Cas9n系統(tǒng)已經(jīng)被運用于構(gòu)建基因敲除細胞系［9］和動物模型［10］。Cas9核酸內(nèi)切酶可以通過sgRNA引導(dǎo)，靶向基因序列的特異性位點，并切割帶有5′-NGG的PAM區(qū)的靶位點。Cas9核酸內(nèi)切酶有HNH和RuvC兩個活性位點，分別在互補和非互補鏈上切割?；パa鏈切割的位點位于PAM區(qū)的5′端的第三個堿基外側(cè)，非互補鏈切割的位點在PAM區(qū)上游的3～8 bp堿基之間，制造出雙鏈DNA斷裂。斷裂的DNA在修復(fù)過程中會啟動同源重組和非同源末端連接，導(dǎo)致DNA鏈發(fā)生突變，在斷裂的位點處插入或缺失部分片段［11］。CRISPR/Cas9n的特異性僅與sgRNA配對的靠近PAM區(qū)處7～12 bp堿基相關(guān)，sgRNA有可能會識別與靶序列存在幾個核苷酸差異的DNA片段，產(chǎn)生脫靶效應(yīng)［12］。Ran等［13］將Cas9在RuvC催化位點進行突變，改造為在sgRNA互補鏈制造單鏈切口的切口酶（Cas9n），由一對sgRNA分別引導(dǎo)來實現(xiàn)靶定切割位點，顯著降低了脫靶效應(yīng)，使CRISPR/Cas9n系統(tǒng)的精確度更高。

另外，CRISPR技術(shù)在醫(yī)學(xué)方面也有很大的應(yīng)用潛力。Kennedy等［14］利用CRISPR系統(tǒng)選擇性地破壞乳頭瘤病毒（HPV）基因，誘導(dǎo)腫瘤的壞死。Yin等［15］利用CRISPR技術(shù)治愈了因單一遺傳突變而患有罕見肝病的小鼠。相信CRISPR技術(shù)在未來會有更廣闊的發(fā)展前景。

3.2 Asxl2基因研究現(xiàn)狀從2003年Asxl2基因發(fā)現(xiàn)至今，越來越多的文章報道Asxl2基因與多種疾病相關(guān)，但是對其調(diào)控疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制的研究尚不深入。Lai等［16-17］研究顯示，Asxl2基因是心臟發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，在哺乳動物心臟中高表達并且用來維持心血管功能。McGinley等［18］研究發(fā)現(xiàn)，Asxl2基因缺失對小鼠有胚胎致死性，Asxl2-/-小鼠心臟會表現(xiàn)出心臟功能的持續(xù)性減退，出現(xiàn)左心室增厚，房間隔缺損等，表現(xiàn)出先天性心臟病的癥狀。Nakahata等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在某些成人T細胞淋巴瘤中會觀察到der（10）t（2；10）（p23；p11.2）發(fā)生易位，使EPC1（enhancer of polycomb 1）基因和Asxl2基因發(fā)生融合，導(dǎo)致這兩個蛋白功能的紊亂，引起疾病的異常表現(xiàn)。此外，在前列腺癌［20］、胰腺癌［21］、乳腺癌［22］和白血?。?3］中都可以觀察到Asxl2基因的突變。

利用本研究構(gòu)建的Asxl2基因敲除的NIH3T3穩(wěn)定細胞系，為將來深入研究Asxl2基因的功能及作用機制提供了工具。

（圖1～3見插頁）

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（2015-01-30收稿 2015-06-03修回）

（本文編輯 李鵬）

Construction of Asxl2 gene knock out stable NIH3T3 cell line with CRISPR/Cas9n system

FANG Jiaping1,2，ZHAO Xiujuan3，QI Yan4，WANG Xi3，WU Xudong3△，LOU Jianshi1△
1 Department of Pharmacology，College of Basic Medical，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Community Health Service Center，Xiaobailou Street，Heping District；3 Deparment of Cell Biology，College of Basic Medical，Tianjin Medical University；4 Tianjin Medical University Eye Hospital△

ObjectiveTo knock out Asxl2 gene in murine embryonic fibroblast cell line NIH3T3 using CRISPR/Cas9n system.MethodsA pair of sgRNAs which targeted exon 5 of Asxl2 gene were designed and subcloned into the pX462 vec?tor.The recombined plasmids were verified by sequencing and transfected into NIH3T3 cell line.Single cells were isolated through serial dilutions,followed by an expansion period to obtain new monoclonal cell lines.The genomic DNA of the new monoclonal cell lines was extracted and a DNA fragment flanked the target site was amplified by genotyping PCR then se?quenced.Lastly,western blotting were applied to confirm whether Asxl2 was successfully knocked out.ResultsThe CRIS?PR/Cas9n plasmids that targeted Asxl2 were successfully constructed.NIH3T3 cells were co-transfected with the two recom?binant constructs.After puromycin selection,subclonal cell lines were obtained and one of them was validated by genotyping PCR-sequencing.Western blotting also confirmed that Asxl2 was completely depleted in the NIH3T3 cell line.ConclusionCRISPR/Cas9n plasmids that targeted Asxl2 were successfully constructed therefore a Asxl2 knockout NIH3T3 stable cell line was established via this system.

ASXL2；CRISPR/Cas9n；CRISPR system；epigenetic

R349.5

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.005

973國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃——組蛋白甲基化酶調(diào)控NK細胞功能的機制與結(jié)構(gòu)研究（2014CB910104）；天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金計劃項目（093-201301）

1天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室（郵編300070）；2天津市和平區(qū)小白樓街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心；3天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)系；4天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院

方佳萍（1986），女，碩士在讀，初級藥師，主要從事藥理學(xué)和表觀遺傳調(diào)控研究

△通訊作者E-mail：wuxudong@tijmu.edu.cn；jianshilou@163.com