王文文，宗曉娟，魏海蓉，王甲威，朱東姿，譚 鉞，劉慶忠

(山東省果樹研究所/山東省果樹生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271000)

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山東泰安甜櫻桃“花葉病”樹體癥狀觀察及病毒檢測(cè)

王文文，宗曉娟，魏海蓉，王甲威，朱東姿，譚 鉞，劉慶忠*

(山東省果樹研究所/山東省果樹生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271000)

為了探明山東泰安患有“花葉病”的甜櫻桃樹體內(nèi)感染病毒的種類，本研究以嫁接在3種不同砧木上的甜櫻桃品種‘紅燈’葉片為試驗(yàn)材料，提取植物樣本總RNA，采用隨機(jī)六聚體引物反轉(zhuǎn)錄，選取10種甜櫻桃病毒作為檢測(cè)對(duì)象，根據(jù)各病毒基因組序列設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，10種甜櫻桃待檢病毒中，5種病毒檢測(cè)結(jié)果呈陽性，分別為PNRSV(Prunusnecroticringspotvirus，PNRSV)、PDV(Prunedwarfvirus，PDV)、CVA(CherryvirusA，CVA)、CGRMV(Cherrygreenringmottlevirus，CGRMV)、LChV-2(Littlecherryvirus-2，LChV-2)，各病毒檢出率較高。各“花葉病”甜櫻桃樣品均至少同時(shí)感染2種病毒，多病毒復(fù)合感染比例較高。

甜櫻桃； 花葉??； 砧木； 病毒； 檢測(cè)

甜櫻桃(PrunusaviumL.)是我國發(fā)展較快的果樹之一，因其上市早、經(jīng)濟(jì)效益高，被列為果樹生產(chǎn)的重要樹種。截至2010年，我國甜櫻桃栽培面積約為11萬hm2，其中，山東省甜櫻桃栽培面積5.0萬hm2，約占全國的45.6%，產(chǎn)量22.0萬t，約占全國的62.9%[1]，其面積及產(chǎn)量均居全國第一。然而，隨著甜櫻桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，病害日益成為影響產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素。由于病毒的危害癥狀與真菌、細(xì)菌的不同，加上果農(nóng)缺少相關(guān)的專業(yè)知識(shí)，往往將其忽略。這樣造成病毒在果園內(nèi)和果園間不斷傳播，多數(shù)甜櫻桃果園樹體因罹患病毒病引起早衰、死亡，嚴(yán)重縮短了果園的經(jīng)濟(jì)壽命[2]。

近年來，山東泰安地區(qū)甜櫻桃‘紅燈’上普遍出現(xiàn)一種病害，發(fā)病葉片上形成淡黃綠色至綠色環(huán)斑或褪綠斑，有的葉片產(chǎn)生黃綠相間的線紋。當(dāng)?shù)毓r(nóng)根據(jù)葉片癥狀將其統(tǒng)稱為甜櫻桃“花葉病”。植株花葉病發(fā)病程度不等，有的個(gè)別枝條出現(xiàn)癥狀，有的整株發(fā)病，感病植株通?；ㄆ谕七t，不能坐果，落花落果現(xiàn)象嚴(yán)重，使果樹產(chǎn)量和品質(zhì)受到極大影響。據(jù)報(bào)道，植物花葉病可能與多種因素有關(guān)，產(chǎn)生的癥狀相似。生理性因素如缺素癥和肥水不足，是黃化型花葉病原因之一。缺磷素葉片出現(xiàn)黃綠和深綠相間的花葉，甚至出現(xiàn)紫紅、紅色的斑塊；櫻桃缺鐵元素幼葉呈黃白色，嫩葉葉脈間失綠，嚴(yán)重時(shí)葉脈也變成黃色，葉片出現(xiàn)棕色枯斑，稱“黃化病”[3-5]。病理性因素如細(xì)菌、真菌、病毒等危害都會(huì)使葉片產(chǎn)生花葉，但病狀和病征不同。真菌引起的花葉如大櫻桃褐斑病，初期在嫩葉上形成具有深色中心的黃色斑，逐漸病斑邊緣變厚并呈黑色或紅褐色，病斑近圓形、淺黃褐色至灰褐色；其病原菌為絲孢目核果釘孢菌(Passaloracircumscissa)[6]，顯微鏡下可見菌絲和孢子；細(xì)菌引起的花葉病如大櫻桃細(xì)菌性穿孔病，其病原為甘藍(lán)黑腐黃單胞菌桃穿孔致病型[Xanthomonascampestrispv.pruni(Smith) Dye]，病斑顯微鏡下可見菌膿溢出；發(fā)病初期葉片上出現(xiàn)半透明水漬狀淡褐色小點(diǎn)，擴(kuò)大成紫褐色至黑褐色圓形不規(guī)則病斑，邊緣角質(zhì)化，周圍有水漬狀淡黃色暈環(huán)[7-8]。病毒侵染亦能引起甜櫻桃“花葉”癥狀。與缺素癥及真菌、細(xì)菌性病害不同，病毒侵染引起的花葉癥狀的突出特點(diǎn)為不均一失綠。據(jù)報(bào)道，侵染大櫻桃的病毒有34種，較為常見的有20種左右，葉片上的主要癥狀復(fù)雜多樣，包括失綠黃化、葉脈白化、小葉、花葉、皺縮、穿孔等[9]。引起櫻桃花葉癥狀的病毒也有多種，如櫻桃壞死環(huán)斑病和皺縮花葉病均由李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)侵染所致。PNRSV 和蘋果褪綠葉斑病毒(Applechloroticleafspotvirus，ACLSV)復(fù)合侵染會(huì)引起櫻桃壞死線紋病，即在葉片上出現(xiàn)帶狀的褪綠斑最終壞死[10]。櫻桃褪綠環(huán)斑病和櫻桃黃花葉病均由李矮縮病毒(PDV)危害所致[10-11]，櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(CGRMV)可以引起櫻桃綠環(huán)斑駁病[12]，櫻桃葉斑駁病毒(Cherrymottleleafvirus，CMLV)導(dǎo)致櫻桃葉斑駁病[13]，櫻桃壞死銹斑駁病毒(Cherrynecroticrustymottlevirus，CNRMV)產(chǎn)生櫻桃壞死銹斑駁病[14]等。甜櫻桃病毒病的病毒種類繁多，以上病毒無論是單獨(dú)侵染還是復(fù)合侵染，都可引起植株花葉癥狀，多病毒復(fù)合侵染危害更重，可導(dǎo)致果樹絕產(chǎn)絕收[10]。

分子生物學(xué)鑒定方法是目前應(yīng)用最多的技術(shù)，此方法比生理學(xué)觀察準(zhǔn)確，比ELISA 靈敏度高，特異性強(qiáng)，且快速、可靠，其中RT-PCR是最簡(jiǎn)單常用的方法之一。本研究以山東泰安地區(qū)嫁接在3種不同砧木上的甜櫻桃品種‘紅燈’為對(duì)象，對(duì)具有花葉癥狀植株的花、葉片及果實(shí)等癥狀表現(xiàn)進(jìn)行觀察記錄，以表現(xiàn)花葉癥狀的葉片為試驗(yàn)材料，利用RT-PCR技術(shù)對(duì)花葉病病樣病毒感染情況進(jìn)行了初步檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于山東泰安肥城邊院鎮(zhèn)甜櫻桃生產(chǎn)園，選取以‘吉塞拉7號(hào)’(G7)、‘吉塞拉5號(hào)’(G5)、‘大青葉’(DQY)為砧木的甜櫻桃‘紅燈’花葉型葉片樣品共12份，以無病毒組培苗作為RT-PCR檢測(cè)的陰性對(duì)照。取材樣品以液氮速凍后置于-70 ℃冰箱保存。

1.2 方法與步驟

1.2.1 總RNA的提取

采用北京天根TIANGEN RNA plant plus reagent作為總RNA提取試劑，方法參照試劑盒小量法提取步驟稍做改動(dòng)，0.1 g植物材料液氮研磨，轉(zhuǎn)至1 mL提取試劑中振蕩混勻，室溫放置5 min，4 ℃ 12 000 r/min離心1 min，轉(zhuǎn)移上清，加0.1 mL 5 mol/L NaCl、加0.3 mL氯仿，顛倒混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上層水相，加等體積異丙醇，混勻，放置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，75%乙醇漂洗沉淀，棄上清，室溫晾干沉淀，加適量DEPC-ddH2O溶解混勻，-70 ℃保存。

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增

反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas (MBI)，取5 μg植物總RNA、1 μL隨機(jī)六聚體引物(0.2 μg/μL)，加適量DEPC-ddH2O至12 μL，70 ℃變性5 min，冰浴冷卻，依次加入4 μL reaction buffer、1 μL ribonuclease inhibitor(20 U/μL)、2 μL dNTP(10 mmol/L)，25 ℃溫育5 min，加入1 μL M-MuLV reverse transcriptase，42 ℃溫育1 h，70 ℃ 10 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)完畢后，產(chǎn)物冰上冷卻，-20 ℃保存?zhèn)溆谩７崔D(zhuǎn)錄產(chǎn)物適量稀釋后用于PCR擴(kuò)增。

選取李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)、李矮縮病毒(PDV)、櫻桃病毒A(CVA)、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(CGRMV)、櫻桃小果病毒-2(LChV-2)、蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)、櫻桃銼葉病毒(Cherryraspleafvirus，CRLV)、櫻桃葉斑駁病毒(CMLV)、櫻桃小果病毒-1(Littlecherryvirus-1，LChV-1)及櫻桃壞死銹斑駁病毒(CNRMV)作為檢測(cè)對(duì)象，根據(jù)GenBank上公布的上述病毒基因組序列為參照，設(shè)計(jì)合成的引物序列如表1。

表1 RT-PCR檢測(cè)引物

選取相應(yīng)引物用于各病毒的檢測(cè)，反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 50 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序

PCR產(chǎn)物連接至pMD 18-T vector(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒，酶切鑒定后樣品送Invetrogen公司測(cè)序，序列分析采用DNAMAN軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜櫻桃花葉病癥狀

以山東省泰安市肥城邊院鎮(zhèn)甜櫻桃生產(chǎn)示范園作為田間癥狀觀察地點(diǎn)，對(duì)果園內(nèi)甜櫻桃品種‘紅燈’花葉病癥狀進(jìn)行觀察記錄。據(jù)觀察，植株從3月底至4月初尚未完全展葉時(shí)即可發(fā)病，至5月底-6月上旬癥狀表現(xiàn)達(dá)到高峰?；ㄈ~型葉片無萎蔫腐爛現(xiàn)象，病斑表面未見霜狀或粉狀霉層，表面無菌膿或黃色暈圈。在早春尚未完全展葉時(shí)葉片上可見黃綠相間的花葉斑駁病斑，隨著葉片展開，病斑出現(xiàn)褪綠黃化現(xiàn)象，伴隨有葉片皺縮、凸起及缺刻癥狀。有的葉片次脈周圍出現(xiàn)淡黃綠色至淺綠色的帶紋、環(huán)斑和褪綠斑，后期環(huán)斑內(nèi)部組織壞死脫落，出現(xiàn)穿孔。感病植株整體生長(zhǎng)遲緩，花朵小而少，結(jié)果量少，果實(shí)偏小，落花落果現(xiàn)象嚴(yán)重(圖1)。冬季葉片花葉癥狀出現(xiàn)隱癥現(xiàn)象，保護(hù)地栽培中發(fā)病較重。

圖1 甜櫻桃花葉病田間癥狀Fig.1 Field symptoms of sweet cherry trees suffering from mosaic disease

2.2 RT-PCR鑒定

提取葉片總RNA，以隨機(jī)六聚體引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，選取各病毒的特異性檢測(cè)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示(圖2)，10種甜櫻桃待檢病毒中，5種病毒檢測(cè)結(jié)果呈陽性，分別為PNRSV、PDV、CVA、CGRMV、LChV-2；3種不同的砧木樣品中都有病毒檢出，花葉型樣品均至少同時(shí)感染2種病毒，多病毒復(fù)合感染比例較高，病毒組合與葉片癥狀表型無明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系。例如，1、2號(hào)為以G5為砧木的褪綠斑駁型甜櫻桃樣品，7～12號(hào)為以G7為砧木的黃綠相間帶紋花葉型甜櫻桃樣品，卻同時(shí)感染PNRSV、PDV、CVA、CGRMV、LChV-2 5種病毒；3～6號(hào)同為DQY砧木的樣品，植株葉片都出現(xiàn)壞死環(huán)斑癥狀類型，但感染病毒組合類型卻不盡相同。然而，不同砧木類型，不同花葉癥狀類型的葉片均同時(shí)感染CGRMV和LChV-2。花葉病甜櫻桃樣品中，嫁接砧木差異與其病毒感染情況并無規(guī)律性可循，說明病毒危害與砧木類型無明顯相關(guān)性。各病毒的檢出率都在83.3%以上，說明花葉病危害植株體內(nèi)普遍存在病毒感染(表2)。為進(jìn)一步驗(yàn)證該檢測(cè)的準(zhǔn)確性，將各病毒檢測(cè)的PCR片段連接至克隆載體pMD18-T vector，克隆測(cè)序，序列結(jié)果與GenBank中各病毒基因組序列相應(yīng)區(qū)段比對(duì)，同源性皆在91%～99.27%之間。以上結(jié)果表明，皺葉型甜櫻桃樹體至少感染5種病毒，而病毒組合類型與葉片癥狀、砧木類型無明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系。

圖2 3種不同砧木的甜櫻桃品種‘紅燈’花葉病樹體內(nèi)5種病毒的RT-PCR檢測(cè)Fig.2 RT-PCR detection of 5 viruses in sweet cherry samples on three different rootstocks

砧木類型Rootstock樣品數(shù)Numberofsamples病毒VirusPNRSVPDVCVACGRMVLChV?2G5222222G7666666DQY423244病毒檢出率/%Virusdetectionrate83．391．683．3100100

3 討論

植物花葉病與多因素相關(guān)，但各因素產(chǎn)生的花葉病癥狀卻不盡相同。本試驗(yàn)根據(jù)各因素產(chǎn)生的癥狀差異排除葉片感染真菌和細(xì)菌的可能[3-8]。據(jù)觀察，田間葉片皺縮，多黃綠相間的斑駁花斑，嚴(yán)重的出現(xiàn)線紋、帶紋或褪綠環(huán)斑，與文獻(xiàn)記錄的病毒病癥狀相似[9]。

試驗(yàn)選取文獻(xiàn)報(bào)道較多、與花葉相關(guān)的10種甜櫻桃病毒為鑒定對(duì)象，以嫁接3種不同砧木類型的花葉型‘紅燈’樣品為材料進(jìn)行RT-PCR鑒定。結(jié)果顯示，感病樣品5種甜櫻桃病毒檢測(cè)呈陽性，且多為病毒復(fù)合侵染。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不同病毒侵染組合與花葉病的不同癥狀類型、不同砧木類型并無直接相關(guān)性。檢出結(jié)果顯示，PNRSV、PDV、CVA檢出率均較高。據(jù)報(bào)道PNRSV可導(dǎo)致大櫻桃壞死環(huán)斑病和皺縮花葉病，葉片皺縮，出現(xiàn)壞死環(huán)斑，后期病斑內(nèi)部脫落形成穿孔，嚴(yán)重時(shí)植株整株枯死，造成絕產(chǎn)[10]；PDV可引起大櫻桃褪綠環(huán)斑病和葉片黃化病，植株產(chǎn)生淡綠色斑點(diǎn)或黃綠相間斑駁，葉脈透明，葉略有皺縮[11]；CVA為我國近來發(fā)現(xiàn)的一種侵染櫻桃的潛隱性病毒，危害癥狀不明顯[16]，但CVA經(jīng)常和櫻桃小果病毒等其他病毒復(fù)合侵染，使果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降[17]，以上癥狀描述均與觀察結(jié)果相符。另外，各樣品均同時(shí)感染CGRMV及LChV-2。關(guān)于CGRMV對(duì)植物的危害尚無明確結(jié)論[18]。而LChV-2是櫻桃小果病的致病原之一，可導(dǎo)致果實(shí)發(fā)育不完全、糖度降低、上色不均勻等，嚴(yán)重影響甜櫻桃的經(jīng)濟(jì)性狀[19-20]。具有花葉病癥狀的甜櫻桃植株通常果實(shí)敗育或坐果率不高，推測(cè)與感染LChV-2有關(guān)。

本研究結(jié)合癥狀觀察與分子生物學(xué)檢測(cè)方法，首次對(duì)山東泰安地區(qū)嫁接在3種不同砧木上的甜櫻桃品種‘紅燈’花葉病病樣病毒感染情況進(jìn)行了調(diào)查，對(duì)當(dāng)?shù)鼗ㄈ~病樹體的癥狀進(jìn)行記錄，初步探明泰安地區(qū)甜櫻桃“花葉病”樹體內(nèi)確有病毒存在?；ㄈ~病植株體內(nèi)有多種病毒存在，樹體花葉類型不同可能與體內(nèi)不同病毒種類的復(fù)合侵染相關(guān)，病毒復(fù)合侵染加重了對(duì)甜櫻桃植株的危害。但關(guān)于以上病毒單獨(dú)或復(fù)合侵染甜櫻桃是否會(huì)引起花葉病，還需要通過試驗(yàn)證實(shí)。接下來我們會(huì)進(jìn)一步進(jìn)行病毒回接試驗(yàn)，根據(jù)科赫氏法則，結(jié)合病毒在草本指示植物及木本指示植物上的癥狀表現(xiàn)，做出最終的判定，為花葉病的分子生物學(xué)鑒定及綜合防治提供可靠的科學(xué)依據(jù)。由于目前病毒病傳播快，危害嚴(yán)重，而無有效的藥物防治，因此，對(duì)果園實(shí)行檢疫、對(duì)病株及時(shí)隔離和疏除、嫁接接穗選用無毒材料是當(dāng)前最有效防治措施。而花葉型葉片可能作為甜櫻桃感染病毒病的指示性癥狀，為今后病害類型的快速診斷奠定基礎(chǔ)。

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Symptom and detection of the virus causing mosaic disease in sweetcherry trees in Tai’an, Shandong

Wang Wenwen, Zong Xiaojuan, Wei Hairong, Wang Jiawei, Zhu Dongzi, Tan Yue, Liu Qingzhong

(Shandong Institute of Pomology, Key Laboratory for Fruit Biotechnology & Breeding of Shandong Province, Tai’an 271000, China)

In order to identify the virus causing the sweet cherry mosaic disease in Tai’an, Shandong Province, leaf samples of sweet cherry cultivar ‘Red Lamp’ showing mosaic symptoms on different rootstocks were selected as the materials for total RNA extraction. Reverse transcription was carried out using random hexamer primer for cDNA synthesis. Specific primers were designed according to the genome sequences of each of the 10 sweet cherry viruses and used for RT-PCR detection. The results indicated that 5 virus species were detected positive, including PNRSV, PDV, CVA, CGRMV and LChV-2. All of the mosaic leaf samples were infected with 2 or more virus species. Mixed infection with various viruses was in a large proportion.

sweet cherry； mosaic disease； rootstock； virus； detection

2014-03-10

2014-06-13

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203075)；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃(2013BAD02B03-3-2)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系水果創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)基金(2014)

S 436.629

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.017

* 通信作者 E-mail： qzliu001@126.com