李 雅，楊 茹，聶 磊，范引科，謝人明

（1．陜西省腫瘤醫(yī)院，西安710061；2．陜西省中醫(yī)藥研究院，西安710003）

抗癌方有效部位群對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響

李 雅1，楊 茹1，聶 磊1，范引科2，謝人明2

（1．陜西省腫瘤醫(yī)院，西安710061；2．陜西省中醫(yī)藥研究院，西安710003）

目的 觀察抗癌方有效部位群對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響。方法 通過(guò)S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)、S180荷瘤小鼠溶血素試驗(yàn)、小鼠肝癌瘤株NK細(xì)胞活性試驗(yàn)，觀察抗癌方對(duì)S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、S180荷瘤小鼠溶血素、C57小鼠肝癌瘤株NK細(xì)胞活性的影響。結(jié)果 抗癌方能夠增強(qiáng)荷瘤小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，促進(jìn)荷瘤小鼠溶血素抗體生成，增強(qiáng)小鼠脾臟NK細(xì)胞活性。結(jié)論 抗癌方可顯著提高荷瘤小鼠免疫功能，增強(qiáng)NK細(xì)胞活性是其可能機(jī)制之一。

抗癌方；免疫功能；自然殺傷細(xì)胞

惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，我國(guó)已進(jìn)入老齡化社會(huì)，腫瘤發(fā)病率及病死率呈高發(fā)趨勢(shì)，從天然植物中尋找低毒、高效的抗癌活性成分藥物仍是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者熱衷的研究課題［1-5］。抗癌方有效部位群（簡(jiǎn)稱抗癌方）出自我院名老中醫(yī)驗(yàn)方，由蟾皮、莪術(shù)、延胡索等諸藥經(jīng)提取、純化得到有效部位成分配伍組合而成。臨床觀察證實(shí)用于肝癌、胃癌等多種腫瘤及癌痛的治療具有較好效果［6-10］。筆者通過(guò)免疫實(shí)驗(yàn)等系列全面探討抗癌方抗腫瘤作用與機(jī)理，為闡明其科學(xué)內(nèi)涵，進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供充分的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 受試藥物 名稱：抗癌方，由蟾皮、莪術(shù)、延胡索等諸藥經(jīng)提取、純化得到有效部位成分配伍組合而成 ，約含蟾毒配基類化合物4.39%，莪術(shù)揮發(fā)油20.00%，異喹啉生物堿5.98%，1 g藥粉相當(dāng)3.02 g原生藥。

1.2 陽(yáng)性藥物 注射用環(huán)磷酰胺：國(guó)藥準(zhǔn)字H14023686，山西普德藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.2 g。成人常用量：?jiǎn)嗡庫(kù)o脈注射按體表面積每次500～1 000 mg／m2，加生理鹽水20～30 mL，靜脈注射，每周1次，連續(xù)2次，休息1～2周重復(fù)聯(lián)合用藥500～600 mg／m2。轉(zhuǎn)移因子口服液：國(guó)藥準(zhǔn)字H20013288，由金花企業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，金花制藥廠生產(chǎn)，規(guī)格10 mL∶10 mg／kg，10～20 mL／次，2～3次／d口服。

1.3 瘤株 小鼠S180肉瘤細(xì)胞株，肝癌細(xì)胞，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 KM小鼠，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（陜）2010-001。C57 BL／6小鼠，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（軍）2010-007。

1.5 試劑 印度墨汁：北京篤信精細(xì)制劑廠生產(chǎn)，規(guī)格100 mL／瓶，批號(hào)0100426。2%冰醋酸溶液：西安化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，批號(hào)110512。氯化鈉注射液：四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格250 mL／瓶，國(guó)藥準(zhǔn)字H61020014。標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，Gibco，上?？婆d商貿(mào)有限公司。二甲基亞砜（DMSO），美國(guó)Fisher Chemica公司。四甲基偶氮唑鹽（MTT），西安舟鼎國(guó)公司。刀豆蛋白A（ConA），西安舟鼎國(guó)公司。胰蛋白酶消化液，西安舟鼎國(guó)公司。RPMI-1640，Gbico公司。96孔培養(yǎng)板，美國(guó)Corning公司。

1.6 儀器 電子天平：型號(hào)（BSA224S-CW），北京賽多利斯天平廠。光學(xué)顯微鏡：olympus CX22LED，奧林巴斯生產(chǎn)。雙人凈化工作臺(tái)，SW-CJ-2D型，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)。高速低溫離心機(jī)：型號(hào)centrifuge 5810R。潔凈工作臺(tái)：Taisite。TDZ4AWS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)。恒溫培養(yǎng)箱：Heraeus。酶標(biāo)儀：BIORAD Model 680 serial NO.13628 Made in Japan。

2 方法

2.1 抗癌方對(duì)S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 按文獻(xiàn)［11-12］方法，ICR小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，取生長(zhǎng)良好的腹水型腫瘤小鼠，脫臼處死，潔凈臺(tái)無(wú)菌操作制備瘤細(xì)胞液 ，計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度為1×107個(gè)／mL，每只小鼠腹腔接種0.2 mL瘤細(xì)胞液，即接種2×106個(gè)瘤細(xì)胞。24 h后隨機(jī)分為6組，空白對(duì)照組，環(huán)磷酰胺組（使荷瘤小鼠免疫低下），陽(yáng)性對(duì)照組，抗癌方大、中、小劑量組（1.00、0.50、0.25 g／kg）。除正常對(duì)照組外，其他各組小鼠肌肉注射環(huán)磷酰胺20 mg／kg造模，連續(xù)注射5 d。造模同時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃轉(zhuǎn)移因子口服液10 mL／kg，其他3組分別給抗癌方，各組灌胃體積均為10 mL／kg，1次／d，連續(xù)給藥10 d。末次給藥后小鼠稱重 ，10%印度墨汁生理鹽水0.1 mL／10 g尾靜脈注入后分別于2、12 min用微量移液器內(nèi)眥靜脈取血20 μL，立刻加入到0.1% Na2CO3溶液2 mL中混勻。以對(duì)照管作為空白，721分光光度計(jì)680 nm處測(cè)定各管OD值。同時(shí)取小鼠肝、脾稱重，按公式計(jì)算吞噬指數(shù)κ及吞噬系數(shù)α值。

2.2 抗癌方對(duì)S180荷瘤小鼠溶血素的影響 按文獻(xiàn)［11-12］方法，選健康ICR小鼠60只，摟2.1分組給藥。首次給藥前腹腔注射0.2 mL 10%綿羊紅細(xì)胞懸液進(jìn)行免疫。末次給藥后1 h，小鼠眼眶取血0.5 mL，1 500 r／min，離心10 min，吸取血清稀釋10倍，取稀釋血清1 mL，與5%綿羊紅細(xì)胞懸液0.5 mL，10%補(bǔ)體1 mL混勻。37℃水浴中放置10 min后取出，孵畢取出終止反應(yīng)。2 000 r／min，離心10 min，取上清液1 mL加3 mL都氏試劑混勻，540 nm處以對(duì)照管作為空白，分別測(cè)定各管OD值，組間比較 t檢驗(yàn)。

2.3 抗癌方對(duì)C57小鼠肝癌瘤株NK細(xì)胞活性的影響 按文獻(xiàn)［11-12］方法，取C57 BL／6小鼠50只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，取種瘤小鼠制備瘤細(xì)胞懸液（1×107／mL），于右前肢腋窩皮下接種2×106個(gè)瘤細(xì)胞懸液。24 h后隨機(jī)分為5組：荷瘤對(duì)照組、環(huán)磷酰胺對(duì)照組、抗癌方大、中、小劑量組。荷瘤對(duì)照組灌胃蒸餾水。環(huán)磷酰胺對(duì)照組灌胃環(huán)磷酰胺（20 mg／kg），抗癌方大、中、小劑量分別為1.00、0.50、0.25 g／kg。各組灌胃體積均為10 mL／kg，連續(xù)給藥14 d，末次給藥后1 h，稱小鼠體質(zhì)量，眼球放血后頸椎脫臼法處死小鼠，取脾臟，研磨，沙網(wǎng)過(guò)濾（200目），加入紅細(xì)胞裂解液（無(wú)菌雙蒸水），裂解3 min，1 000 r／min離心10 min，取出淋巴細(xì)胞，生理鹽水沖洗2次，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為 5×106／mL，于 37 ℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)備用。

將制備調(diào)密度為3.1×106／mL的脾細(xì)胞懸液與用培養(yǎng)液調(diào)密度為1.4×105／mL的靶細(xì)胞L929，以25∶1比例接種于96孔培養(yǎng)板，每只小鼠均設(shè)6孔，其中5孔加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞總體積200 μL，充分混勻；1孔為效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照，加入效應(yīng)細(xì)胞和RPMI-1640（含10%小牛血清）各100 μL；設(shè)靶細(xì)胞對(duì)照，加入靶細(xì)胞和RPMI-1640各100 μL；于37℃5%CO2條件培養(yǎng)20 h后取出，吸出上清；每孔加入MTT（5 mg／mL）試液10 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸出上清；每孔加入DMSO 100 μL，充分振蕩，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm測(cè)吸收度。記錄OD值。

3 結(jié)果

3.1 抗癌方對(duì)S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 見(jiàn)表1。

表1 抗癌方對(duì)S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（±s，n＝10）

表1 抗癌方對(duì)S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（±s，n＝10）

注：與環(huán)磷酰胺組比較 ，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

／α荷瘤對(duì)照組 10mL／kg 2．42±0．45 4．76±0．78＃環(huán)磷酰胺組 20 2．08±0．42 3．68±0．98轉(zhuǎn)移因子組 10 2．12±0．21 5．25±0．72＃?？拱┓酱蠼M 1．00 g／kg 2．32±0．32 4．71±0．41＃抗癌方中組 0．50 g／kg 2．26±0．45 4．36±0．75?？拱┓叫〗M 0．25 g／kg 2．29±0．26 4．07±0．68組 別 劑量／（mg／kg） 肝脾重／g 吞噬系數(shù)

3.2 抗癌方對(duì)S180荷瘤小鼠溶血素的影響 見(jiàn)表2。

表2 抗癌方對(duì)S180荷瘤小鼠溶血素的影響（±s，n＝10）

表2 抗癌方對(duì)S180荷瘤小鼠溶血素的影響（±s，n＝10）

注：與環(huán)磷酰胺組比較 ，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組 別 劑量／（mg／kg） OD值荷瘤對(duì)照組 10mL／kg 0．085±0．031＃＃環(huán)磷酰胺組 20 0．032±0．021轉(zhuǎn)移因子組 10 0．096±0．029＃＃抗癌方大組 1.00 g／kg 0．076±0．032＃?？拱┓街薪M 0.50 g／kg 0．062±0．056?？拱┓叫〗M 0.25 g／kg 0．051±0．024＃

3.3 抗癌方對(duì)C57小鼠肝癌瘤株NK細(xì)胞活性的影響 見(jiàn)表3。

表3 抗癌方對(duì)小鼠肝癌瘤株NK細(xì)胞活性的影響（±s，n＝10）

表3 抗癌方對(duì)小鼠肝癌瘤株NK細(xì)胞活性的影響（±s，n＝10）

注：與荷瘤對(duì)照組比較 ，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組 別 劑量／（mg／kg） OD值荷瘤對(duì)照組 10mL／kg 11．38±19．42環(huán)磷酰胺組 20 7．25±14．38抗癌方大組 1.00 g／kg 34．23±16．03＃?？拱┓街薪M 0.50 g／kg 29．22±18．56＃抗癌方小組 0.25 g／kg 23．65±12．69＃

4 小結(jié)

本研究結(jié)果表明：1）抗癌方能明顯加強(qiáng)荷瘤小鼠的巨噬細(xì)胞碳粒廓清能力；2）對(duì)免疫低下荷瘤小鼠溶血素抗體生成有促進(jìn)的作用；3）具有增強(qiáng)小鼠脾臟NK細(xì)胞活性的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示抗癌方能夠顯著升高荷瘤小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，具有增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能的作用；對(duì)荷瘤小鼠溶血素抗體生成有促進(jìn)作用，能夠提高機(jī)體體液免疫功能；提示抗癌方具有增強(qiáng)小鼠脾臟NK細(xì)胞活性的作用。綜合評(píng)價(jià)抗癌方具有增強(qiáng)荷瘤小鼠免疫功能的作用；抗癌方通過(guò)增強(qiáng)小鼠脾臟NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性是其增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的機(jī)制之一；抗癌方具有通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能發(fā)揮抗腫瘤的作用?？拱┓街卸喾N中藥來(lái)源的化學(xué)成分不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接的細(xì)胞毒殺傷作用，而且能夠從不同途徑提高腫瘤患者的免疫功能，在“祛邪”的同時(shí)且能“扶正”［13-17］。筆者將繼續(xù)通過(guò)協(xié)同增效等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步全面探討抗癌方抗腫瘤作用與機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供充分的科學(xué)依據(jù)。

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Effective parts of anticancer prescription on immune function of tumor-bearing mice

LI Ya1，YANG Ru1，NIE Lei1，F(xiàn)AN Yinke2，XIE Renming2
（1．Department of Medical Oncology，Shaanxi Provincial Tumor Hospital，Xian 710061，China；2．Shaanxi Institute of Trational Chinese Medicine，Xian 710003，China）

Objective To observe the immune effects of anticancer prescription effective parts on tumor-bearing mice．Methods To observe anticancer prescription effective parts effects on immune function of tumor-bearing mice，by the macrophage phagocytic function of S180tumor-bearing mice in experiment of peritoneal，S180tumor-bearing mice hemolysin test，C57 mice liver cancer tumor strains of NK cell activity test．Results Anticancer prescription effective parts can enhance the phagocytic function of reticuloendothelial cells in tumor-bearing mice．To promote the formation of hemolysin antibody in tumor-bearing mice，enhance NK cell activity of spleen in tumor-bearing mice．Conclusion Anticancer prescription significantly improving the immune function of tumor-bearing mice and promoting the activity of NK cell is one of the possible mechanisms．

anticancer prescription；immune function；NK cell

R285.5

A

2095-6258（2015）05-0922-03

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．014

2015-07-20）

陜西省中醫(yī)管理局課題“抗癌方有效部位群抗腫瘤作用的研究”（2012-JC18）。

李 雅（1975-），女，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)科腫瘤臨床研究。