李鵬飛 鄭丹寧 周 佳 王 健 張波朱 昌余力

丹參、黃芪注射液對自體脂肪移植存活率的影響

李鵬飛 鄭丹寧 周 佳 王 健 張波朱 昌余力

目的觀察中藥丹參、黃芪注射液對自體脂肪移植成活率的影響，為后續(xù)實驗及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法建立新西蘭白兔自體脂肪移植動物模型，實驗組分別予以腹腔注射丹參、黃芪注射液，于不同時間點采血、取材，測定血清VEGF表達水平和脂肪存活率，HE染色觀察組織細胞形態(tài)，血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子CD31、周脂素免疫組化染色觀察毛細血管密度及細胞活性。結(jié)果自體脂肪移植術(shù)后第12周，實驗組脂肪存活率顯著高于對照組；各時間點實驗組血清VEGF表達水平均顯著高于對照組；HE、CD31、周脂素染色示，實驗組在細胞形態(tài)、新生毛細血管密度及細胞活性方面均明顯優(yōu)于對照組。結(jié)論配合應(yīng)用丹參、黃芪注射液，能夠顯著提高新西蘭白兔自體脂肪移植的存活率。

丹參注射液黃芪注射液自體脂肪移植存活率

自體脂肪具有取材簡便、來源豐富、充盈外觀好、組織相容性好等優(yōu)點[1-5]，臨床上被用于修復(fù)因軟組織缺損引起的各種先天性和后天性畸形。然而自體脂肪移植頗高的吸收率卻使得其臨床應(yīng)用受到限制。研究表明，提高自體脂肪移植細胞的存活能力，早期重建移植組織的血供，對于自體脂肪移植的存活具有重要意義[6]。

丹參又名赤參，是最常用的活血化瘀中藥之一，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩、養(yǎng)血安神之功效[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參常用于治療心血管系統(tǒng)疾病，具有改善微循環(huán)、促進血管新生、抗腫瘤、抗肝纖維化、預(yù)防應(yīng)激性潰瘍、調(diào)節(jié)免疫、抗菌消炎等作用[8-11]。黃芪是最常用的益氣中藥之一，具有補氣升陽、益衛(wèi)固表、托毒生肌、利水消腫的功效[12]?，F(xiàn)代藥理學(xué)認為，黃芪對心血管、循環(huán)、物質(zhì)代謝、肝腎功能及腫瘤等均可發(fā)揮良好的治療作用[13-14]。黃芪具有顯著的抗氧化活性，能夠抑制自由基的產(chǎn)生，并且能夠有效清除機體內(nèi)過剩的自由基，使得細胞減輕或免受自由基產(chǎn)生的過度氧化作用，保護線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，從而起到保護細胞、延長細胞壽命的作用[15]。本實驗建立新西蘭白兔自體脂肪移植動物模型，觀察比較丹參、黃芪注射液對自體脂肪移植中對細胞保護、血運重建、毛細血管新生及成活率的影響，為進一步實驗和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、材料

丹參注射液、黃芪注射液（正大青春寶）；ELISA試劑盒（R&D公司，美國）；鼠單克隆抗CD31因子抗體（Abcam公司，英國）；鼠抗免疫組化試劑盒（欣博盛公司）；羊抗人多克隆抗周脂素抗體（Bio-Sciences公司，英國）；生物素標(biāo)記兔抗山羊IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；堿性磷酸酶（Sigma-Aldrich公司，美國）；BCIP/NBT顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物及分組

健康新西蘭白兔12只（我院動物實驗中心提供），雌雄不限，體質(zhì)量2.7±0.3 K g。隨機分成3組：對照組4只，行自體脂肪移植術(shù)+腹腔注射生理鹽水；實驗組1（丹參組）4只，行自體脂肪移植術(shù)+腹腔注射丹參注射液2.5 g/K g·d；實驗組2（黃芪組）4只，行自體脂肪移植術(shù)+腹腔注射黃芪注射液2.5 g/Kg·d。術(shù)前1周至術(shù)后3周用藥，持續(xù)4周。

1.2.2 自體脂肪移植動物模型

圖1術(shù)中暴露新西蘭白兔肩胛區(qū)脂肪組織并游離Fig.1 The adipose tissue was exposed and dissociated in the New Zealand white rabbit's scapular area

圖2 將移植脂肪組織注射入兔耳背部皮下Fig.2 Autologous adipose tissue was injected into the dorsum of the ears subcutaneously

動物術(shù)前禁食12 h。全麻后，備皮，俯臥位固定于清潔手術(shù)臺上，背部肩胛區(qū)正中線距頸部約5 cm處作5 cm長切口，垂直切開皮膚及皮下組織，顯露附著于背闊肌筋膜淺層的脂肪墊（圖1），取出脂肪組織約4～5 m L。轉(zhuǎn)移到PBS溶液中，沖洗，剪碎，獲得直徑約1～2 mm的脂肪顆粒。消毒耳背部皮膚，將脂肪顆粒置入2 m L注射器，以12號注射針頭分別注入雙耳背部皮下4個部位，每次0.6～0.7 m L（圖2）。

1.2.3 標(biāo)本采集與檢測

分別于術(shù)中、術(shù)后1、2、4、6、8周在兔后腿外側(cè)表淺靜脈取血，每只取血1～2 m L，取上層血清，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測VEGF表達水平。術(shù)后第2、4、12周取材，于移植體周邊切開皮膚，沿被膜仔細分離，完整取下脂肪移植體，分離修去周圍組織及包膜，精密稱重，與術(shù)前記錄對比計算存活率。4%多聚甲醛固定標(biāo)本24 h，石蠟包埋切片，行HE染色及血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子CD31、周脂素免疫組化染色。HE染色后，以囊和空泡、纖維化、結(jié)締組織以及淋巴和巨噬細胞浸潤的炎癥反應(yīng)等作為指標(biāo)，按嚴重程度將組織形態(tài)劃分為0到5級：0級，重度彌漫性分布；1級，中到重度彌漫；2級，中度分布；3級，輕到中度分布；4級，偶然出現(xiàn)；5級，無出現(xiàn)[16]。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS13.0軟件進行處理，計量資料采用t檢驗或單因素方差分析，存活率比較采用卡方檢驗，等級資料采用Kruskal Wallis檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自體脂肪移植組織大體觀察

移植術(shù)后取材，存活良好的移植體表現(xiàn)為質(zhì)地柔軟、邊界清晰、活動度好的組織團塊，呈暗黃色，外部被一層纖維組織包膜所包裹，界線較明顯（圖3）。

2.2 存活率的比較

移植術(shù)后第2、4周，對照組與各實驗組存活率無顯著性差異（P＞0.05）；術(shù)后第12周，各實驗組存活率均明顯高于對照組（P＜0.05）；實驗組間未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。丹參組存活率最高，黃芪組次之，對照組最低（圖4）。

圖3 脂肪組織移植體體積對比（左起：對照組、黃芪組、丹參組）Fig.3 The volume com parison among representative grafts in different groups.The sequence from the left:control group, astragalus propinquus group and salvia m iltiorrhiza group

圖4 移植術(shù)后各組脂肪移植體存活率比較Fig.4 The survival rates of grafts of three groups after transplantation

2.3 血清VEGF的表達水平

實驗組VEGF表達水平在移植術(shù)的當(dāng)天及術(shù)后1、2、4、6、8周與對照組比較均有明顯增高（P＜0.05）；黃芪組在各時間點表達水平較丹參組稍高，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖5）。

圖5 各組血清VEGF表達水平比較Fig.5 The expression levels of VEGF in serum in each group

2.4 組織學(xué)觀察

圖6 術(shù)后第2、4、12周，各組HE染色觀察（200×）Fig.6 Histological observation by HE staining 2,4,12 weeks after transplantation(200×)

HE染色顯示，丹參組的脂肪細胞存活最好，形態(tài)上較完整，脂滴大小一致，血液供應(yīng)較充裕；黃芪組的存活情況尚好，細胞的完整度稍差，有更多的結(jié)締組織隔膜和炎性浸潤，卻有更豐富的新生血管；對照組存活情況最差，有很多大而不規(guī)則的空泡及較嚴重的組織纖維化（圖6）。

2.5 血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子CD31免疫組化染色

對照組脂肪組織中血運不豐富，新生血管不明顯。實驗組移植體組織中血管較豐富，又以周邊區(qū)域更多。實驗組中又以黃芪組新生血管數(shù)量更多，較多分布于細胞間的結(jié)締組織內(nèi)；丹參組新生血管數(shù)量較少，散在分布于細胞周邊島狀結(jié)締組織中（圖7）。

圖7 各組CD31免疫組化染色（200×）Fig.7 The expression of platelet endothelial cell adhesion molecule-1(CD31)in each group by immune-histochem istry (200×)

2.6 周脂素免疫組化染色

對照組移植體組織中染成晶藍色的脂肪細胞少，多位于移植體的邊緣，表明脂肪細胞活性較差；實驗組有活性的脂肪細胞相對多，又以丹參組更多。丹參組有活性的脂肪細胞較多，脂肪細胞邊緣染成完整的晶藍色，存活較好；黃芪組有部分活性脂肪細胞，呈淺藍色，細胞活性相對較差（圖8）。

圖8 各組周脂素免疫組化染色（200×）Fig.8 The expression of perilipin in each group by immune-histochemistry(200×)

3 討論

自體脂肪移植已廣泛應(yīng)用于以美容和重建為目的軟組織充填中[17]。但移植后較高的吸收率導(dǎo)致治療效果存在不確定性，成為自體脂肪移植進一步發(fā)展的障礙，也是近年來研究的重點和難點[18-19]。

促進脂肪細胞增殖分化、加快移植組織的血供重建是提高存活率的關(guān)鍵因素。隨著分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)的發(fā)展，在各種因子應(yīng)用于提高脂肪移植存活率的研究中，除VEGF外，尚有諸如b-FGF、前列腺素E1、瘦素（Leptin）、EGF、富血小板血漿（Platelet-Rich Plasma，PRP）、ANG-1、PDGF等，均可不同程度地促進移植脂肪組織的存活[20-26]。然而，這些因子大多價格昂貴，半衰期短，臨床效果個體差異較大。盡管目前已有相當(dāng)數(shù)量的基礎(chǔ)和臨床研究初步驗證了應(yīng)用生長因子的有效性，但我們對生長因子仍然存在著質(zhì)疑，擔(dān)憂其可能帶來的不良反應(yīng)及并發(fā)癥，這種擔(dān)憂主要是一些腫瘤組織中存在著生長因子或相關(guān)基因的高表達，或是某些生長因子本身就是癌基因的產(chǎn)物[27-28]。臨床應(yīng)用生長因子是否能導(dǎo)致過度表達，甚至誘發(fā)腫瘤，仍然是值得特別關(guān)注的問題。

近來，中藥的相關(guān)研究也開展得越來越深入，許多藥理作用得到了較廣泛的認同。在中醫(yī)理論中，丹參是最常用的活血化瘀的藥物之一。據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)的研究，丹參的水溶性成分具有很強的清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用[29-30]。其有效成分可用于治療心血管疾病，且對內(nèi)皮細胞還有保護作用。此外，丹參還能提高紅細胞的變形能力，改善微循環(huán)障礙，有促進血管新生、抗腫瘤、抗肝纖維化、預(yù)防應(yīng)激性潰瘍、調(diào)節(jié)免疫、抗菌消炎等作用[8-11]。鑒于自體脂肪移植對血供的需求，我們通過引入丹參來探討和觀察其對自體脂肪移植的影響。

黃芪常與丹參搭配使用，是最常用的益氣中藥之一。具有補氣升陽、益衛(wèi)固表、托毒生肌、利水消腫之功[12]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪對心血管、循環(huán)、物質(zhì)代謝、肝腎功能及腫瘤治療等疾病均可發(fā)揮良好的治療作用[13-14]。黃芪具有顯著的抗氧化活性，能夠?qū)ψ杂苫漠a(chǎn)生起到抑制作用，并能有效清除機體內(nèi)過剩的自由基，使得細胞減輕或免受自由基產(chǎn)生的過度氧化作用，保護線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，從而起到保護細胞、延長細胞壽命的作用[15]。研究顯示，黃芪確有提高自體脂肪移植存活率的作用[31]。鑒于黃芪保護細胞、延長細胞壽命和丹參改善微循環(huán)的作用，我們通過丹參、黃芪對自體脂肪移植的作用來比較兩者對自體脂肪移植的影響，希望能為將來的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

本實驗結(jié)果顯示，自體脂肪移植術(shù)后第12周，兩實驗組的存活率明顯高于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異。提示應(yīng)用丹參、黃芪注射液有助于提高自體脂肪移植成活率?？赡芤浦搀w血管新生和血運重建是一個相對緩慢的過程，在早期（第2、4周）誘導(dǎo)足量新生血管形成之前，各組之間的差異不明顯。

血清VEGF結(jié)果顯示，丹參、黃芪組的表達水平在移植術(shù)的當(dāng)天及術(shù)后第1、2、4、6、8周與對照組比較均有明顯增高，推測中藥制劑在移植術(shù)后的早期發(fā)揮了擴張小動脈和改善微循環(huán)的作用，同時上調(diào)了VEGF的表達。實驗組在VEGF的作用下誘導(dǎo)毛細血管新生，以增加移植組織所需的血供。

血管內(nèi)皮細胞因子CD31免疫組化法染色結(jié)果顯示，對照組移植脂肪組織中血運不豐富，新生血管少。中藥組移植體組織中新生血管較豐富，又以周邊區(qū)域更多。中藥組中又以黃芪組新生血管數(shù)量較多。周脂素免疫組化法染色結(jié)果顯示，中藥處理的兩實驗組相對對照組有活性的脂肪細胞分布更廣泛、數(shù)量更多，其中又以丹參組活性高、數(shù)量多。

結(jié)合HE、CD31和周脂素的染色結(jié)果，通過丹參、黃芪組間的比較可以發(fā)現(xiàn)，丹參組在細胞形態(tài)上最好，而血管數(shù)量不是最豐富，多分布在細胞周邊的島狀結(jié)締組織中；黃芪組的細胞形態(tài)不是最好，但血供卻較為豐富，血管多數(shù)分布在細胞間增生的結(jié)締組織內(nèi)，豐富的血供可能并未能在脂肪細胞的成活上發(fā)揮重要作用。因此我們推測，丹參和黃芪在細胞保護、抗氧化和誘導(dǎo)血管新生、血運重建方面均發(fā)揮了較為重要的作用。就本實驗結(jié)果而言，丹參可能在細胞保護方面作用略佳，在上調(diào)VEGF水平和血管新生方面兩種中藥效果相仿。

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The Effects of Salvia m iltiorrhiza and Astragalus propinquus In jection on the Survival of Autologous Adipose Tissue Transplantation

LI Pengfei,ZHENG Danning,ZHOU Jia,WANG Jian,ZHANG Bo,ZHU Chang,YU Li.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China.Corresponding author:YU Li(E-mail:yuoli@163.com).

Objective To explore the effects of Salvia miltiorrhiza and Astragalus propinquus injection on the survival of transplanted grafts,so as to provide evidence for further research and clinical application.M ethods Autologous adipose tissue transplantation model was established using New Zealand white rabbit.The experimental groups were given S. miltiorrhiza and A.propinquus injection intraperitoneally.The expression levels of VEGF in serum and survival rates were measured and calculated at different time points.Tissue morphology was observed by HE staining.The expression of platelet endothelial cell adhesion molecule-1(CD31)and perilipin were observed by immune-histochemistry to evaluate the neocapillary growth and cyto-activity of transplanted adipose tissue.Results Twelve weeks after transplantation,the survival rates in experimental groups were higher than the control group.The expression levels of VEGF in serum in experimental groups were significantly higher than those in the control group at each time point.HE and immuno-histochemical staining demonstrated better morphology,denser neo-capillaries and higher cyto-activity in experimental groups,compared with the control group.Conclusion By applying S.miltiorrhiza and A.propinquus injection,the survival of autologous transplanted adipose tissue can be significantly enhanced in New Zealand rabbits.

Salvia miltiorrhiza injection;Astragalus propinquus injection;Autologous adipose tissue transplantation; Survival rate

R622+.9

A

1673－0364（2015）03－0144－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.03.007

2015年3月17日；

2015年4月26日）

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

余力（E-mail：yuoli@163.com）。