傅春江 ，毛廷森，曾泉，陳琳，周軍年，賈雅麗，岳文

1.房山區(qū)中醫(yī)院，北京 102400；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 野戰(zhàn)輸血研究所，全軍干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)研究室，北京 100850

小干擾RNA（miRNA）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演的角色近年來(lái)成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，并取得一系列突破性進(jìn)展。miRNA 被證明在機(jī)體的正常發(fā)育過(guò)程中，以及包括腫瘤在內(nèi)的疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-2]。研究表明，miRNA 參與干細(xì)胞的干性維持以及向成熟細(xì)胞的定向分化過(guò)程，對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程具有調(diào)控作用，并通過(guò)不同的信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[3-5]。值得關(guān)注的是，多種miRNA 被發(fā)現(xiàn)在肝癌中異常表達(dá)，并對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，從而在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。對(duì)這些miRNA 的深入研究，將有望為發(fā)現(xiàn)新的肝腫瘤標(biāo)志物及新的診療靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)[6-7]。

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，居我國(guó)癌癥死亡原因第2 位，在全世界范圍內(nèi)為發(fā)病率最高的第五大惡性腫瘤，其死亡率在惡性腫瘤死亡順位中居第3 位。肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素的復(fù)雜過(guò)程，涉及眾多生長(zhǎng)因子、癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)或激活，乙肝病毒和丙肝病毒所導(dǎo)致的癌變，酒精所致的肝損傷等[8-10]。除此之外，近年越來(lái)越多的研究表明，腫瘤微環(huán)境在肝癌的演進(jìn)過(guò)程中有不容忽視的重要作用[11-12]。肝癌微環(huán)境由多種基質(zhì)細(xì)胞組成，包括間充質(zhì)干細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等，它們能夠分泌大量的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬降解酶等，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥[13-14]。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)細(xì)胞呈激活狀態(tài)并高表達(dá)EPM、S-100A4 等因子，繼而引起腫瘤細(xì)胞系列基因表達(dá)的改變及生物學(xué)行為的改變[15]。我們系統(tǒng)地對(duì)間質(zhì)細(xì)胞引起的MHCC-97H 等肝癌細(xì)胞中miRNA 表達(dá)的改變進(jìn)行篩選與分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的miR-155在間質(zhì)細(xì)胞的刺激下明顯表達(dá)上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)在肝癌細(xì)胞系SK-HEP-1 及MHCC-97H 中過(guò)表達(dá)miR-155，研究其對(duì)肝腫瘤細(xì)胞增殖與浸潤(rùn)等生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞系SK-HEP-1 及MHCC-97H 由本室保存；pcDNA3.0-miR-155真核表達(dá)載體由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所鄭曉飛教授饋贈(zèng)；限制性內(nèi)切酶、核酸分子量標(biāo)記等購(gòu)自寶生物公司；引物合成由上海英駿公司完成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量用SYBR Green 染料購(gòu)自QIAGEN 公司；CCK8購(gòu)自日本同仁株式會(huì)社；高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone 公司；TRIzol 及LipofectAMINE 2000試劑購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將SK-HEP-1 及MHCC-97H 細(xì)胞接種于6 孔板中，用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。采用LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每孔加入溶解于opti-MEM 的10 μL LipofectAMINE 2000 和4 μg pcDNA3.0-miR-155 質(zhì)粒DNA，對(duì)照組加入與實(shí)驗(yàn)組等量的LipofectAMINE 2000和pcDNA3.0質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)染第2 d換液，72 h后收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于miRNA的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)miR-155 在細(xì)胞中的表達(dá)水平

用QIAGEN 公司的miScriptⅡRT 試劑盒進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 后，采用SYBR Green 法實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)，上游引物為5'-TTAATGCCTAATC GTGATAGGGGTC-3',下游引物為5'-GATTGAATC GAGCACCAGTTAC-3'。PCR 條件：95℃ 15 min；95℃15 s，55℃30 s，72℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。以U6基因?yàn)閮?nèi)參，上游引物為5'-CGCTTCGGCAGCACA TATACTA-3'，下游引物為5'-GATTGAATCGAGCA CCAGTTAC-3'，PCR 條件同上。各組PCR 均進(jìn)行3復(fù)孔重復(fù)。

1.4 CCK8法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染24 h 的細(xì)胞以每孔2×103/100 μL 的密度接種于96 孔板，培養(yǎng)24、72 和120 h 后分別進(jìn)行CCK8 檢測(cè)。加入10 μL CCK8，繼續(xù)在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h，檢測(cè)D450nm值，每組均進(jìn)行6 復(fù)孔重復(fù)。增殖倍數(shù)計(jì)算公式：每一次測(cè)定的吸光度值/第一次測(cè)定的吸光度值。

轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞以2×103/孔的密度接種于6孔板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3 d 換液，2 周后棄去培養(yǎng)液，PBS 洗3 次，加入0.1%結(jié)晶紫溶液（含10%福爾馬林）固定20 min，棄去結(jié)晶紫溶液后用自來(lái)水柔和沖洗，自然干燥后照相保存。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的浸潤(rùn)能力

-20℃保存的Matrigel于4℃過(guò)夜融化，用無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶6 稀釋Matrigel，充分混勻；取400 μL 稀釋的Matrigel 加入Tanswell 板上室，37℃30 min 后Matrigel聚合成膠；細(xì)胞用PBS漂洗3次，用無(wú)血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，每個(gè)小室加入5×105細(xì)胞，置于6孔板中，48 h后觀察照相并計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.0-miR-155真核表達(dá)載體的鑒定

用限制性內(nèi)切酶HindⅢ/XhoⅠ對(duì)pcDNA3.0-miR-155 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在350 bp 及5.4 kb 左右出現(xiàn)條帶，符合預(yù)期結(jié)果（圖1）；測(cè)序后與GenBank（NR_030784）序列比對(duì)一致。

2.2 miR-155 在SK-HEP-1 及MHCC-97H 肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)

將SK-HEP-1 及MHCC-97H 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)至密度為70%～80%（圖2），細(xì)胞狀態(tài)良好，呈長(zhǎng)梭形（SK-HEP-1）或多邊形（MHCC-97H）上皮樣細(xì)胞狀態(tài)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-miR-155 質(zhì)粒72 h 后，對(duì)SKHEP-1 及MHCC-97H 細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，以檢測(cè)miR-155的表達(dá)情況，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.0質(zhì)粒為對(duì)照，結(jié)果顯示陽(yáng)性組比對(duì)照組表達(dá)水平高約424.8±48.5倍（SK-HEP-1，P＜0.01）與63.69±7.8倍（MHCC-97H，P＜0.01）（圖3），這說(shuō)明pcDNA3.0-miR-155 質(zhì)粒能有效地高表達(dá)成熟的miR-155。

2.3 miR-155高表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響

CCK8 法檢測(cè)結(jié)果表明，pcDNA3.0-miR-155 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SK-HEP-1 及MHCC-97H 細(xì)胞24、72、120 h后，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.0 對(duì)照載體組相比，在72 h 后細(xì)胞增殖受到明顯的促進(jìn)，miR-155 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SKHEP-1 與對(duì)照組在72 h 的增殖倍數(shù)分別為4.59±0.14 與3.04±0.15（P＜0.01），miR-155 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組MHCC-97H 與對(duì)照組在72 h 的增值倍數(shù)分別為3.78±0.12 與3.35±0.38（P＜0.01）（圖4）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)是將單細(xì)胞懸液以較低的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)孔板中，經(jīng)過(guò)相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)來(lái)考察單個(gè)細(xì)胞的增殖能力，miR-155 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SK-HEP-1 與對(duì)照組在72 h 的克隆形成數(shù)目分別為410.00±11.36 與189.33 ± 12.66（P＜0.01），miR-155 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組MHCC-97H 與對(duì)照組在72 h 的克隆形成數(shù)目分別為226.00±6.08與144.33±14.98（P＜0.01）（圖5），說(shuō)明miR-155促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖。

圖1 pcDNA3.0-miR-155質(zhì)粒的HindⅢ/XhoⅠ雙酶切鑒定

2.4 miR-155高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的浸潤(rùn)能力

Transwell檢測(cè)結(jié)果表明，pcDNA3.0-miR-155質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SK-HEP-1 與對(duì)照組浸潤(rùn)數(shù)目分別為143.00±9.36與76.00.33±10.67（P＜0.01），二者差異具有顯著意義（P＜0.01）（圖6）。

3 討論

圖2 SK-hep1（A）及MHCC-97H（B）肝癌細(xì)胞（×200）

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-miR-155后SK-hep1及MHCC-97H肝癌細(xì)胞中miR-155的表達(dá)

圖4 miR-155促進(jìn)SK-hep1及MHCC-97H肝癌細(xì)胞增殖

圖5 克隆形成實(shí)驗(yàn)證明miR-155促進(jìn)SK-HEP-1（A）及MHCC-97H（B）肝癌細(xì)胞增殖

圖6 侵襲實(shí)驗(yàn)證明miR-155促進(jìn)SK-HEP-1細(xì)胞的浸潤(rùn)

越來(lái)越多的研究表明，除了腫瘤細(xì)胞本身發(fā)生的遺傳學(xué)或表觀遺傳學(xué)的改變之外，腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境也在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演至關(guān)重要的角色[10-11]。腫瘤微環(huán)境包括內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等。我們課題組曾經(jīng)系統(tǒng)研究肝腫瘤微環(huán)境對(duì)肝癌發(fā)生與發(fā)展的影響并取得一定的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了肝癌微環(huán)境中的肝星狀細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞等在腫瘤細(xì)胞的影響下呈現(xiàn)明顯激活狀態(tài)，高表達(dá)EPM 及S100-A4 等因子，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生明顯影響：促進(jìn)腫瘤的增殖，明顯增加了腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)能力，在腫瘤微環(huán)境激活細(xì)胞的刺激下，腫瘤細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)移甚至肺轉(zhuǎn)移的能力增加[15]。進(jìn)一步弄清腫瘤微環(huán)境中的這些因子的分子調(diào)控機(jī)制，將有望為明確腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制，以及發(fā)現(xiàn)新的腫瘤診療靶標(biāo)提供線索。

在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)在肝腫瘤微環(huán)境的刺激下，肝腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為發(fā)生了改變，包括細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移能力的提高等。此外，我們的研究也發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的miRNA 表達(dá)譜發(fā)生了變化，包括miR-155、miR-301、miR-222、miR-107 等在內(nèi)的miRNA 的表達(dá)明顯上調(diào)，其中miR-155 表達(dá)的改變最為顯著。miR-155 是一個(gè)典型的多功能基因，目前已被報(bào)道參與多種生理與病理過(guò)程，如炎癥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。在急性髓細(xì)胞樣白血病中，miR-155 的表達(dá)明顯升高；此外，在多種實(shí)體瘤中，包括甲狀腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌及宮頸癌等，miR-155 的表達(dá)顯著上升，并可能與患者的病理分級(jí)及預(yù)后有一定的相關(guān)性，但其對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用及分子調(diào)控機(jī)制仍須進(jìn)一步明確[16-17]。

為了進(jìn)一步揭示肝腫瘤微環(huán)境是否通過(guò)miR-155 發(fā)揮其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，我們通過(guò)pcDNA3.0-miR-155載體在SK-HEP-1及MHCC-97H 肝癌細(xì)胞中高表達(dá)miR-155，并研究miR-155對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及浸潤(rùn)能力的影響。研究結(jié)果證實(shí)，miR-155 發(fā)揮了與腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞類似的生物學(xué)作用，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與浸潤(rùn)能力，提示miR-155參與了腫瘤微環(huán)境，有促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展的過(guò)程。這有助于我們進(jìn)一步明確肝腫瘤微環(huán)境作用的病理機(jī)制，而miR-155 在肝癌細(xì)胞中的高表達(dá)并對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為造成影響，為臨床上肝癌的分子診斷及治療提供了新思路與新靶點(diǎn)。

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