丁妙霞，葉惠儀，黃江志，黃炳熾，鐘群芳，張險(xiǎn)朋

（1.廣東省東莞市橫瀝鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523460；2東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東 東莞 523086）

一例犬布魯氏菌病的診斷

丁妙霞1，葉惠儀1，黃江志1，黃炳熾2，鐘群芳2，張險(xiǎn)朋2

（1.廣東省東莞市橫瀝鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523460；2東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東 東莞 523086）

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌屬的細(xì)菌感染引起的一種人畜共患性傳染病，是一種以長(zhǎng)期發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、肝脾腫大和病程慢性化為主要特征的機(jī)體變態(tài)反應(yīng)性疾病。本病分布廣泛，且有抬頭趨勢(shì)，給畜牧業(yè)和人的健康帶來(lái)較大的危害。目前，流產(chǎn)布氏桿菌（牛種菌，Brucella abortus）、豬種菌（B.suis）、馬爾他布氏桿菌（羊種菌，B.melitensis）和犬種菌（B.canis）對(duì)人類致病，且其致病力有所差異。中心近期接診一例懷疑為布魯氏菌感染的犬只，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料中心在2015年4月27日接診一只犬，根據(jù)主訴，品種為貴賓，年齡3歲，從當(dāng)?shù)貙櫸锏曩?gòu)買，2015年3月14日配種，2015年4月24日出現(xiàn)流產(chǎn)，送到當(dāng)?shù)氐囊婚g寵物診所求診，該診所用快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)為布魯氏菌抗體陽(yáng)性，初步懷疑是布魯氏菌病。

1.2 病料采取犬全血離心分離血清，4℃保存待檢，用棉拭子采集陰道分泌物用50%甘油PBS液放4℃保存待檢。

1.3 試劑布魯氏菌病虎紅抗原購(gòu)自美國(guó)IEDXX公司，批號(hào)：382-10。布魯氏菌試管凝集抗原購(gòu)自中監(jiān)所，批號(hào)：150138011。布魯氏菌病熒光PCR試劑盒購(gòu)自上海之江生物技術(shù)有限公司，批號(hào):H20150401。

1.4 方法

（1）虎紅平板凝集試驗(yàn)方法按照《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》GB/T 18642-2002操作，在虎紅平板凝集板上加30μl血清，在受檢血清旁邊加30μL抗原，用牙簽攪動(dòng)血清和抗原使之混合，用時(shí)設(shè)陰性、陽(yáng)性血清對(duì)照。在陰性、陽(yáng)性血清對(duì)照成立的條件下，對(duì)被檢血清進(jìn)行判定，受檢血清在4min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)凝集現(xiàn)象判為陽(yáng)性，無(wú)凝集現(xiàn)象判為陰性。

（2）試管凝集試驗(yàn)方法按照《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》GB/T 18642-2002操作。

（3）熒光PCR方法取50μL樣本，加50μL核酸提取液充分混勻，沸水浴10min，然后13000rpm離心10min，去上清4μL作為PCR反應(yīng)模板。按照每個(gè)反應(yīng)體系35μL布魯氏菌核酸熒光PCR檢測(cè)混合液與1μL內(nèi)部對(duì)照品，以及0.4μL酶，加入4μL提取的PCR反應(yīng)模板。熒光PCR反應(yīng)參數(shù)為，37℃，2min；93℃，15s，60℃，60s，循環(huán)40次。陽(yáng)性對(duì)照FAM通道CT值小于或等于35，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線試驗(yàn)成立，樣品FAM通道小于或等于38判為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果用虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行初

篩，檢測(cè)血清，肉眼可見(jiàn)凝集現(xiàn)象，血清抗體陽(yáng)性。

2.2 試管凝集試驗(yàn)結(jié)果采用試管凝集試驗(yàn)對(duì)虎紅平板凝集試驗(yàn)陽(yáng)性的血清進(jìn)行確認(rèn)，抗體滴度達(dá)到1：100，確定為布魯氏菌抗體陽(yáng)性。

2.3 熒光PCR結(jié)果采用熒光PCR方法檢測(cè)陰道分泌物，陽(yáng)性質(zhì)控ct值為19.5，樣品ct值為21，陰性質(zhì)控?zé)o擴(kuò)增曲線，樣品布魯氏菌病陽(yáng)性，詳見(jiàn)圖1。

3 討論

根據(jù)血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)的結(jié)果，結(jié)合臨床癥狀，初步診斷為該犬只感染布魯氏菌病，也是東莞市首次檢測(cè)到犬的布魯氏菌病。布魯氏菌的病原學(xué)診斷主要是從血液或者感染的組織中分離培養(yǎng)布魯氏菌來(lái)確診。布魯氏菌的分離培養(yǎng)是診斷布魯氏菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于布魯氏菌的分離率比較低，容易污染，若加上抗生素，則分離效率更低，此外，分離所需要的時(shí)間比較長(zhǎng)，至少3～8d，有時(shí)甚至達(dá)45d。另一方面，分離布魯氏菌對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和要求較高并存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)，需要在生物安全防護(hù)級(jí)別比較高的才能進(jìn)行分離培養(yǎng)。鑒于實(shí)驗(yàn)室的條件，此次試驗(yàn)未對(duì)熒光PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)。此次試驗(yàn)采用熒光PCR方法檢測(cè)陰道分泌物結(jié)果為陽(yáng)性，證明應(yīng)用熒光PCR方法檢測(cè)布魯氏菌是可行的，熒光PCR具有靈敏性和特異性高，能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染、實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)。目前，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域，特別是近幾年來(lái)在動(dòng)物疫病的診斷中得到了廣泛的應(yīng)用。凝集試驗(yàn)是布魯氏菌病診斷的一種常用的方法，包括血清凝集實(shí)驗(yàn)、乳環(huán)沉淀試驗(yàn)和抗人免疫球蛋白試驗(yàn)，其中標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(yàn)是我國(guó)的法定的檢測(cè)方法?；⒓t平板凝集抗原是用抗原性良好的布魯氏菌菌株經(jīng)培養(yǎng)，滅活，離心收集菌體后用虎紅染料染色后懸浮于乳酸緩沖液中制成，該方法靈敏度高，價(jià)格便宜，操作方便，檢測(cè)快速，適于動(dòng)物群體布魯氏菌病的普查。在國(guó)際貿(mào)易中是牛、羊、豬布魯氏菌病檢測(cè)的指定試驗(yàn)，在我國(guó)也用于動(dòng)物布魯氏菌病監(jiān)測(cè)的初篩。

布魯氏菌病對(duì)人的危害不同種類的布魯氏菌大多具有不同宿主間交叉感染的能力，并具有極為明顯的宿主危害傾向性。人類布魯氏菌病主要來(lái)自動(dòng)物，主要是通過(guò)接觸發(fā)病及帶菌動(dòng)物和被布魯氏菌污染的畜產(chǎn)品而感染。犬的布魯氏菌病是人感染該病的傳染源之一，犬的布魯氏菌對(duì)人類具有致病性，雖然犬的布魯氏致病性不及羊種、牛種和豬種，但也對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成很大的威脅。對(duì)于該犬只檢出布魯氏病，建議對(duì)該犬只實(shí)施安樂(lè)死，并進(jìn)行無(wú)害化處理，加強(qiáng)對(duì)環(huán)境的清潔和消毒。同時(shí)，要加強(qiáng)對(duì)家畜布魯氏菌病的監(jiān)測(cè)，摸清家畜中布魯氏菌感染的情況，為布魯氏菌病的防控、凈化奠定基礎(chǔ)。

圖1 熒光PCR方法檢測(cè)樣品布魯氏菌病結(jié)果圖

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．08.085