陳相　巢暉　計亮年

(中山大學化學與化學工程學院生物無機與合成化學教育部重點實驗室，廣州510275)

靶向抑制拓撲異構(gòu)酶和端粒酶的釕配合物研究進展

陳相巢暉＊計亮年＊

(中山大學化學與化學工程學院生物無機與合成化學教育部重點實驗室，廣州510275)

金屬配合物抗腫瘤研究，尤其是鉑類藥物，已取得了相對令人矚目的成功，但同時也面臨著包括耐藥性和毒副作用等諸多問題。近年來釕配合物作為新的抗癌藥物引起了人們的注意。在非鉑系藥物中，金屬釕配合物是最有前途的抗癌藥物之一，國際上普遍認為釕和釕的配合物屬于低毒性，容易吸收并在體內(nèi)很快排泄。本文將著重介紹釕配合物與DNA結(jié)合后進一步引發(fā)的細胞內(nèi)核酶活性抑制研究，從新的角度來詮釋釕配合物的抗腫瘤研究最新進展。

釕配合物；拓撲異構(gòu)酶；G-四鏈體；端粒酶

0　引言

自從1953年DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)和提出至今60多年以來，生物學的研究逐漸進入了全新的分子生物學時代。脫氧核糖核酸(DNA)在生命體內(nèi)扮演生命遺傳信息的攜帶者和傳遞者，它不僅對于每一個物種生命的延續(xù)、保持各種物種間的遺傳特性、調(diào)控生物體的生長發(fā)育代謝衰老等起著重要的作用，而且在生物變異(如腫瘤、遺傳病等)、進化等生命活動的延續(xù)也密切相關(guān)?；贒NA突變是導致細胞癌變的重要因素之一，因此DNA也成為了一種藥物在生物體中重要的靶分子。傳統(tǒng)的以DNA為靶分子的抗腫瘤藥物，如第一代鉑族抗腫瘤藥物順鉑(Cisplatin)，及隨后經(jīng)過結(jié)構(gòu)優(yōu)化的卡鉑(Carboplatin)及奧沙利鉑(Oxaliplatin)等金屬配合物類藥物，它們的作用機理主要是通過化合物與DNA結(jié)合，從而影響DNA的正常復制過程[1-4]。但目前，耐藥性成為鉑類抗腫瘤藥物臨床應用最大阻礙，由于許多患者先天擁有或后天產(chǎn)生對鉑類抗腫瘤藥物的耐藥性，導致了藥物活性嚴重下降。近年來，釕配合物作為新的抗癌藥物引起了人們的注意，逐漸成為在非鉑系藥物中最有前途的抗癌藥物之一[5-7]。人們在最初設計合成釕配合物作為抗腫瘤試劑時，由于對該體系的認識還不夠全面，設計的思路依然遵循鉑類抗癌藥物中的有效規(guī)律，將其應用到釕抗癌藥物研究上，將DNA共價結(jié)合的能力作為抗腫瘤活性的最高評價標準。但是隨著研究的不斷深入，科學家們發(fā)現(xiàn)小分子化合物與DNA結(jié)合后不僅造成DNA復制的受阻，同時還會影響細胞核內(nèi)部的多種酶(如拓撲異構(gòu)酶，端粒酶等)與DNA的相互作用，通過不同的通路，引起腫瘤細胞的凋亡[8]。因此，目前以DNA為靶分子的酶抑制劑抗腫瘤藥物研究受到了廣泛的關(guān)注并取得了許多令人矚目的成就。而金屬配合物，尤其是釕配合物，與有機化合物相比，具有非常明顯的優(yōu)勢：第一，釕配合物在生物體內(nèi)易于吸收，同時也易于代謝，既容易產(chǎn)生藥效，又不會在體內(nèi)積聚產(chǎn)生毒性，因此具有較好的生物利用度和較低的毒性；第二，釕配合物采取八配位，具有更加豐富多變的結(jié)構(gòu)，這種多變的結(jié)構(gòu)比鉑類化合物更能匹配復雜多變的生物大分子；第三，釕配合物具有豐富的光物理和光化學性能，也有良好的熱穩(wěn)定性，特別是隨著如今合成理論的成熟，手段的發(fā)展，人們可以很方便地創(chuàng)造出帶有不同配體的配合物，而通過配體或者配合物構(gòu)型的改變，則可以來調(diào)節(jié)配合物與靶向分子間的親合力以及結(jié)合模式，從而獲得新穎的活性配合物，同時，通過對電子轉(zhuǎn)移方向和還原電位的調(diào)控，還可以實現(xiàn)光電的活化。因此近年來，釕配合物作為抗癌藥物和相關(guān)探針的研究引起了人們極大的興趣。其中，配合物與DNA的相互作用得到了較多的重視。

鑒于以上觀點，本文將結(jié)合我們課題組的相關(guān)工作，對近年來釕(Ⅱ)多吡啶配合物作為拓撲異構(gòu)酶及端粒酶抑制劑的研究進展進行介紹。

1　拓撲異構(gòu)酶抑制劑

1.1拓撲異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)與功能

細胞核內(nèi)DNA擁有大量的堿基對用以涵蓋其需要攜帶的所有遺傳信息，如果DNA呈線型分子存在，則其長度將遠大于細胞核所能容納的體積范圍，因此DNA在細胞核內(nèi)部呈現(xiàn)高度折疊的高級結(jié)構(gòu)狀態(tài)。但是在細胞內(nèi)多種涉及核酸的活動中，如轉(zhuǎn)錄、復制和修復過程等，都需要核酸序列遺傳信息的表達和參與，此時又要求DNA以解旋后的低級結(jié)構(gòu)存在。因此，生物有機體中，需要有一定的機制來實現(xiàn)高級與低級結(jié)構(gòu)之間的轉(zhuǎn)化功能：將松散的DNA折疊壓縮，以及將高度密集纏繞的DNA解開。DNA拓撲異構(gòu)酶在這一機制中起到關(guān)鍵的作用，是存在于細胞核內(nèi)的一類特殊的酶家族。DNA拓撲異構(gòu)酶同時擁有DNA內(nèi)切酶和DNA連接酶的雙重功能。在拓撲異構(gòu)酶參與的反應過程中，它可以先通過切斷DNA的磷酸二酯鍵，增加或者減少DNA鏈的環(huán)數(shù)，然后重新連接，改變DNA的超螺旋狀態(tài)或者解開纏繞的DNA片段，通過以上過程，控制DNA復雜拓撲結(jié)構(gòu)的變化[9-10]。

根據(jù)拓撲異構(gòu)酶催化機制的不同，主要將其分為TypeⅠ和TypeⅡ兩類。TypeⅠ拓撲異構(gòu)酶為單體酶，包括TopoⅠA、TopoⅠB和TopoⅠC三種亞型。TypeⅡ拓撲異構(gòu)酶為同源二聚體酶，包括Topo IIα、TopoⅡβ2種亞型[11]。在人類細胞中，主要包含DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ(TopoⅠ)和DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)2種，分別屬于于Topo IB和TopoⅡα這2個類型。其中TopoⅠ含有765個氨基酸，其相對分子質(zhì)量為91 KD；TopoⅡ則分為相對分子量分別為170 KD和180 KD的α和β2種亞型[9]。TopoⅠ和TopoⅡ在功能上有相似之處，也有明顯的不同，兩者在對DNA拓撲結(jié)構(gòu)的改變過程中功能相互補充。TopoⅠ可以在DNA雙鏈上的一條單鏈中產(chǎn)生斷裂缺口，另一單鏈則從缺口處穿過(圖1)，以此改變DNA的超螺旋或螺旋不足；TopoⅡ作用過程中，在DNA主鏈上切割產(chǎn)生雙鏈斷裂位點，另一條DNA雙鏈則從斷裂缺口處穿過(圖2)，TopoⅡ不但具有Topo I改變DNA的超螺旋或螺旋不足的功能，同時還能將細胞有絲分裂過程中DNA完成復制后交聯(lián)的姐妹染色單體分開。除了上述過程，TopoⅡ還與細胞核內(nèi)DNA的復制、轉(zhuǎn)錄、重組及DNA纏繞為染色體的組織等過程密切相關(guān)，是所有真核生物細胞中不可或缺的關(guān)鍵酶[12]。

1.2拓撲異構(gòu)酶抑制劑作用機理

由于DNA拓撲異構(gòu)酶在生命活動中扮演著重要的角色，并且已有研究表明，因為腫瘤細胞的細胞核內(nèi)反應較正常細胞更為活躍，造成DNA拓撲異構(gòu)酶在腫瘤細胞中的表達水平高于正常細胞，因此，以DNA拓撲異構(gòu)酶為靶點的抑制劑，有望成為抗腫瘤藥物的研發(fā)創(chuàng)造一條新的途徑。目前已發(fā)現(xiàn)靶向拓撲異構(gòu)酶的抑制劑已經(jīng)非常多，它們對拓撲異構(gòu)酶抑制作用的機理大致可分為毒性機理和催化抑制機理。

拓撲異構(gòu)酶毒劑是指抑制劑通過與拓撲異構(gòu)酶和DNA形成的Topo-DNA共價復合物相結(jié)合，形成穩(wěn)定的三元復合物，從而提高斷裂復合物的穩(wěn)態(tài)濃度，導致拓撲異構(gòu)酶誘導的DNA瞬時斷裂變?yōu)椤坝谰谩睌嗔?，以干擾正常的催化循環(huán)[13]。拓撲異構(gòu)酶催化抑制劑則是通過影響酶的結(jié)構(gòu)或功能，又或是阻斷酶催化反應過程中的某一個或多個步驟，從而實現(xiàn)對拓撲異構(gòu)酶催化活性的抑制作用[14]。

圖1　Topo I結(jié)構(gòu)及作用機理圖Fig.1　Structure and mechanism of topoisomerase I

圖2　TopoⅡ結(jié)構(gòu)及作用機理圖Fig.2　Structure and mechanism of topoisomeraseⅡ

1.3釕(Ⅱ)多吡啶配合物作為拓撲異構(gòu)酶抑制劑

與有機化合物相比，一方面金屬配離子本身帶電荷，可增加化合物的溶解性；另一方面金屬配合物分子結(jié)構(gòu)具有更大的可塑性，通過更換配體或在配體上引入活性基團，可以針對不同的底物結(jié)合環(huán)境進行相應的結(jié)構(gòu)修飾；而且其豐富的光電磁性質(zhì)將有助于探索某些復雜的生命過程，同時金屬配合物還可以為選擇不同抑制對象、調(diào)控藥物活性提供多種潛在的途徑。早在1999年，印度科學家Kondapi就對一系列茂釕配合物作TopoⅡ催化抑制劑進行了相關(guān)的研究[15]。但至今為止，仍僅有少數(shù)幾例金屬配合物抑制DNA拓撲異構(gòu)酶的研究報道。計亮年院士和巢暉教授課題組通過利用釕(Ⅱ)多吡啶配合物的優(yōu)勢，針對拓撲異構(gòu)酶抑制劑方面開展了系列研究工作，我們發(fā)現(xiàn)一些釕多吡啶配合物對DNA拓撲異構(gòu)酶II有明顯的抑制效果[16-17]。但是近期研究發(fā)現(xiàn)，對一種DNA拓撲異構(gòu)酶的選擇性抑制可以引起另一種DNA拓撲異構(gòu)酶的過度表達[18-20]，例如依托泊苷、拓撲替康和伊立替康的聯(lián)合用藥不是協(xié)同作用治療腫瘤。一些靶向TopoⅡ的藥物在治療中可以誘發(fā)二次惡性腫瘤[21]。腫瘤涉及到多種致病因素，設計具有TopoⅠ和Topo IIⅡ雙重抑制活性的藥物將是解決這一問題的有效途徑之一。在2011年，我們設計合成了2個新型的釕(Ⅱ)配合物[Ru(bpy)2(bfipH)]2+ (1)和[Ru(phen)2(bfipH)]2+(2)(圖3)[22]，通過紫外說吸收光譜，DNA熱變實驗及粘度實驗研究了這3個配合物與DNA結(jié)合的行為，結(jié)果證實配合物可以有效地插入DNA堿基對之間。2個配合物因具有與DNA插入結(jié)合的能力，可以較好地穩(wěn)定拓撲異構(gòu)酶與DNA結(jié)合形成的中間產(chǎn)物或阻止拓撲異構(gòu)酶與DNA相結(jié)合，因此具有較好地拓撲異構(gòu)酶抑制活性。通過實驗證實，2個配合物同時對TopoⅠ和TopoⅡ都有抑制活性，抑制濃度IC50均在10 μmol·L-1數(shù)量級。通過對其機理的研究表明，配合物對TopoⅠ遵循催化抑制機理，是TopoⅠ的催化抑制劑；對于TopoⅡ則表現(xiàn)出催化抑制劑和毒劑的雙重效果。這是首例報道關(guān)于對DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ和Ⅱ雙重抑制的金屬配合物。

圖3　[Ru(bpy)2(bfipH)]2+和[Ru(phen)2(bfipH)]2+結(jié)構(gòu)Fig.3　Structure of[Ru(bpy)2(bfipH)]2+and[Ru(phen)2(bfipH)]2+

圖4　Δ-和Λ-[Ru(bpy)2(ipad)]2+結(jié)構(gòu)Fig.4　Structure of Δ-and Λ-[Ru(bpy)2(ipad)]2+

圖5　作為TopoⅠ和TopoⅡ雙重抑制劑的新型釕配合物結(jié)構(gòu)Fig.5　Structure of novel ruthenium complexes as dual inhibitors of TopoⅠandⅡ

此外，我們還設計合成了一對手性釕(Ⅱ)多吡啶配合物Δ-和Λ-[Ru(bpy)2(ipad)]2+(3,4)(圖4)[23]，通過紫外可見光譜，DNA熱變等實驗證實配合物有較強的DNA堿基對插入能力。而拓撲異構(gòu)酶抑制實驗和DNA遷移實驗證實2個配合物對TopoⅠ和TopoⅡ表現(xiàn)出有效地雙重抑制效果。這2個配合物對HeLa，MCF-7，HepG2及BEL-7402等腫瘤細胞表現(xiàn)出較高的抑制生長活性。通過流式細胞儀對其細胞周期阻滯情況進行了進一步的研究，發(fā)現(xiàn)配合物可以選擇性的將細胞阻滯在G1和G2/M期，并顯著的增加了細胞凋亡的數(shù)量。而單細胞凝膠電泳實驗也驗證了配合物可以有效地引起細胞DNA碎片化，這也是引起細胞凋亡的重要因素之一。

圖6　可作拓撲異構(gòu)酶抑制劑多個新型釕(Ⅱ)多吡啶配合物結(jié)構(gòu)Fig.6　Structure of novel ruthenium polypyridyl complexes as topoisomerase inhibitors

最近，我們進一步報道了一系列新型釕(Ⅱ)多吡啶配合物(5～15)(圖5)，這些配合物均表現(xiàn)出了優(yōu)異的TopoⅠ和TopoⅡ雙重抑制效果[24-26]?？偟膩砜矗饘倥浜衔飳NA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ和Ⅱ的雙重抑制研究目前還是全新研究方向。

同時在近年來，國內(nèi)多個課題組也對釕(Ⅱ)配合物作拓撲異構(gòu)酶抑制劑的相關(guān)研究進行了相關(guān)的報道。譚黎峰課題組報道了一系列帶有不同主配體的釕(Ⅱ)配合物，研究了主配體與配合物抑制拓撲異構(gòu)酶活性的構(gòu)效關(guān)系進行了詳細的研究[27-28]。劉云軍，劉學文等課題組也先后在該領域開展了深入的研究，設計合成了多個結(jié)構(gòu)各異的釕(Ⅱ)多吡啶配合物(16～25)，并對它們的拓撲異構(gòu)酶抑制活性進行了探索[29-31](圖6)。

2　端粒酶抑制劑

2.1端粒和端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能

每一個真核細胞的染色體都包含了1個DNA的單分子以及多種與之結(jié)合的蛋白。真核細胞的染色體DNA分子是線型的，因此也就包含了2個末端(這一點與原核生物不同，大腸桿菌中的染色體是1個封閉的圓，即不具有端部)。1個典型的真核生物染色體DNA分子中含有包含了兩部分，分別是基因(即可以編碼蛋白質(zhì)和RNA的序列)以及穿插在基因序列中的非編碼DNA。非編碼DNA中很長一段構(gòu)成了著絲粒和分布在染色體的末端構(gòu)成了端粒。端粒與細胞的壽命密切相關(guān)，同時他們的存在能避免細胞內(nèi)多個染色體發(fā)生意外的交聯(lián)。人類的端粒由多達2000個含有5′-GGTTAG-3′的重復序列組成。

細胞在分裂過程中，由于線型的染色體DNA進行時，DNA聚合酶在合成DNA新鏈過程中，只能沿著模板鏈3端向5端移動，這一過程使得DNA復制面臨了一些問題。正常情況下，該過程進行非常順利，因為以染色體的3端作為DNA聚合酶的復制起點可以使得DNA聚合酶由3端向5端不間斷地移動，直到DNA聚合酶到達下一個復制的起點或染色體的末端。但是，相反的以染色體的5端為模板向3端復制的過程卻是不連續(xù)的。當復制叉充分地打開后，DNA聚合酶才可以開始由3端向5端合成互補鏈被打開的一小部分部分(岡崎片段)，隨后再由DNA連接酶(DNA ligase I)將不連續(xù)合成的岡崎片段連接在一起。這一復制過程將持續(xù)進行，直到接近染色體的末端。

隨著復制叉接近染色體DNA的末端，此時不再有足夠的模板形成新的岡崎片段。這一原因?qū)е铝嗣恳粋€新合成的DNA鏈的5端都不能完整的保留，所以每個子染色體相較于母鏈都將有一個縮短了的端粒。據(jù)估計，在每一次有絲分裂過程中，人類端粒DNA大約會丟失100個堿基對[32-33]。這100個堿基對對應約16個GGTTAG重復，按照這個速度，約經(jīng)歷125次有絲分裂后，端粒就會完全消失[34-35]。所以端粒在有絲分裂過程中穩(wěn)定地縮短這一行為將會對細胞的壽命造成影響。實際情況也如上所預測，置于培養(yǎng)基中的正常細胞(非腫瘤細胞)并不能無限的生長下去。

圖7　靶向端粒G-四鏈體的端粒酶抑制劑作用機理示意圖Fig.7　Mechanism of G-quadruplex targeted telomerase inhibitors

端粒酶是一種核糖核蛋白。它也是一種稱作TERC(Telomere RNA Component)的snoRNA(Small Nucleolar RNA)分子，它能在哺乳動物細胞內(nèi)提供了一個CCAAUC模板用以引導GGTTAG插入端粒。端粒酶的蛋白成分，稱為TERT(Telomere Reverse Transcriptase)則提供催化作用。因此可以認為端粒酶是一種從RNA模板合成的DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶。端粒酶通常只在以下幾種細胞中存在，包括生殖細胞，胚胎干細胞，某些單細胞真核生物(如嗜熱四膜蟲)以及某些或所有的體內(nèi)的干細胞(包括正常干細胞和腫瘤干細胞)。端粒酶的存在，使得這些細胞具有了不斷分裂的能力。

區(qū)分腫瘤細胞與正常組織的重要特征之一是腫瘤細胞具有無限增殖的能力。在大約85%～90%的腫瘤細胞中端粒酶有過表達的現(xiàn)象[36-39]，這造成了腫瘤干細胞擁有無限增殖的能力，導致腫瘤組織的增大(圖7)。因此對端粒酶的抑制，從而實現(xiàn)抑制腫瘤細胞分裂，誘導腫瘤細胞進入衰老及程序性死亡過程的研究已成為抗腫瘤研究的一個新的方向。

2.2端粒酶抑制劑研究進展

通過小分子化合物誘導穩(wěn)定端粒3端懸垂單鏈序列(約150～200個含有TTAGGG核苷酸是單鏈)形成G-四鏈體，G-四鏈體并非端粒酶的底物，該結(jié)構(gòu)將阻止端粒酶與端粒的結(jié)合而實現(xiàn)抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄端粒序列的效果，抑制了端粒的延長(圖7)。同時由于表達端粒酶蛋白亞基的基因啟動子序列同樣可以形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，因此通過穩(wěn)定基因啟動子序列使其形成G-四鏈體，端粒酶的表達將受到抑制，該方法則可以從根源上減少端粒酶的表達量。

基于以上觀點，靶向G-四鏈體的小分子端粒酶抑制劑備受關(guān)注，目前已有多種類型的小分子被用于該方向的研究。由于具有潛力形成G-四鏈體的DNA序列多數(shù)存在于基因啟動子及端粒中，尤其是誘導端粒序列形成G-四鏈體并不會對正常細胞造成過大的影響，因此特異性識別端粒序列并誘導其形成G-四鏈體的小分子化合物將對腫瘤細胞具有很強的選擇性，這也會大大降低了其對正常細胞的毒性，減少用藥過程中可能產(chǎn)生的毒副作用。雖然目前已有大量的靶向端粒DNA的G-四鏈體誘導穩(wěn)定試劑被廣泛的研究和報道，它們在體外結(jié)合人端粒的G-四鏈體的能力也已被確認(包括端粒抑素，及吖啶類化合物)，但是仍然沒有一個靶向端粒DNA的G-四鏈體誘導穩(wěn)定試劑進入臨床研究，主要的障礙在于這些化合物仍然具有較多的不適合作為藥物的性質(zhì)。但是繼續(xù)基于此方向，進一步優(yōu)化及改善這一類前藥的結(jié)構(gòu)，或開發(fā)在生物體內(nèi)具有較好效果的靶向端粒DNA的G-四鏈體誘導穩(wěn)定試劑仍然具有廣闊的前景[40-42]。

2.3釕(Ⅱ)多吡啶配合物作為端粒酶抑制劑

計亮年院士課題組在2008年報道了一個可以誘導和穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)的雙核釕配合物[43]。隨后計亮年院士和巢暉教授課題組將釕配合物可穩(wěn)定G-四鏈體這一性質(zhì)進一步發(fā)揮，探索了其作為靶向端粒G-四鏈體的端粒酶抑制劑的可能性。在2010年，我們課題組報道了2個三核釕(Ⅱ)多吡啶配合物(26,27)(圖8)[44]，通過圓二色譜實驗發(fā)現(xiàn)，這2個配合物可以顯著地誘導人端粒序列DNA發(fā)生構(gòu)型的轉(zhuǎn)變，而FRET熔點實驗則進一步說明配合物對G-四鏈體結(jié)構(gòu)有優(yōu)秀的穩(wěn)定能力。這是第一例對多核釕配合物與人端粒G-四鏈體DNA相互作用的研究報道，也為進一步探索釕配合物作為端粒酶抑制劑的相關(guān)研究奠定了基礎。

圖8　三核釕(Ⅱ)多吡啶配合物結(jié)構(gòu)Fig.8　Structure of trinuclear ruthenium polypyridyl complexes

在上面的基礎之上，我們組繼續(xù)了相關(guān)工作，先后報道了一系列靶向G-四鏈體的釕(Ⅱ)多吡啶配合物(28～31)，并進行了端粒酶抑制劑方面的研究(圖9)[45-46]。從圓二色譜實驗數(shù)據(jù)可以證實，所報導的配合物均能一定程度上誘導人端粒DNA序列形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，隨后的FRET熔點實驗表明配合物對這一類G-四鏈體結(jié)構(gòu)有較好的穩(wěn)定作用。競爭實驗進一步證實相對雙鏈DNA，配合物與G-四鏈體的結(jié)合具有較好的選擇性。以上均表明這一系列配合物在體外有優(yōu)秀的誘導和穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)的能力，這一點是作為靶向G-四鏈體的端粒酶抑制劑的基礎條件。隨后通過PCR終止實驗和TRAP實驗評價了這一系列配合物對端粒酶活性的抑制情況，結(jié)果表明在配合物存在的條件下，可以通過誘導富含鳥嘌呤的模板序列形成G-四鏈體，從而終止了DNA聚合酶對模板序列的擴增。同時，在與配合物共同孵育后，端粒酶對端粒的延長能力發(fā)生了下降，對照組的加入排除了其它影響因素，很好的驗證了配合物可以通過誘導端粒序列形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)從而抑制端粒酶的活性，這一系列配合物對端粒酶的抑制IC50均處于微摩爾至納摩爾級別。通過對細胞生長狀態(tài)影響的評估，發(fā)現(xiàn)這系列配合物通過使用沒有急性毒性的濃度對細胞進行長期孵育后，對細胞產(chǎn)生了抑制生長的效果，這一性質(zhì)很好的避免了藥物對正常細胞的毒性，使其僅對端粒酶過表達的細胞產(chǎn)生較好的抑制效果。

圖9　單核釕(Ⅱ)多吡啶配合物結(jié)構(gòu)Fig.9　Structure of mononuclear ruthenium polypyridyl complexes

圖10　雙核釕(Ⅱ)多吡啶配合物結(jié)構(gòu)Fig.1　0Structure of dinuclear ruthenium polypyridyl complexes

圖11　部分可誘導端粒形成G-四鏈體并抑制端粒酶活性的新型釕配合物結(jié)構(gòu)Fig.1　1Structure of novel ruthenium complexes that can induce telomeric sequence into G-quadruplex and inhibit telomerase activity

在2015年，我們組再次對多核釕多吡啶配合物作端粒酶抑制劑的工作進行了新的報道(32～35)(圖10)[47]，相比單核配合物，雙核配合物擁有更好的水溶性，結(jié)構(gòu)的多變性的優(yōu)勢。報道中還對橋聯(lián)配體部分的結(jié)構(gòu)差異與它們對端粒酶的抑制活性之間的構(gòu)效關(guān)系進行了初步的探究。

通過利用釕(Ⅱ)配合物誘導端粒序列DNA形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)從而抑制端粒酶活性的研究已取得許多成就。國內(nèi)的劉杰課題組以及石碩和姚天明課題組設計和合成了一系列具有誘導和穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)的釕(Ⅱ)配合物(36～41)，并探究了配合物穩(wěn)定G-四鏈體對端粒酶活性的影響，在這方面工作中作出了許多突出的貢獻(圖11)[48-57]。

3　釕配合物作為拓撲異構(gòu)酶和端粒酶雙重抑制劑

盡管對于拓撲異構(gòu)酶和端粒酶之間存在的聯(lián)系目前尚不明確，但是已有科學家開始嘗試將這2種酶的抑制劑共同使用以求達到更好的治療腫瘤的效果。在2003年，Hurley等[58]研究了多種可能同時擁有TopoⅡ毒劑性質(zhì)和G-四鏈體穩(wěn)定能力的小分子化合物，發(fā)現(xiàn)這一系列化合物在對一些Topo II抑制劑有抗藥性的細胞表現(xiàn)出了十分優(yōu)秀的抗腫瘤活性。隨后Von等[59]科學家在一些金屬配合物方面的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的效果。然而，目前并沒有對拓撲異構(gòu)酶抑制劑和端粒酶抑制劑兩者的功能相結(jié)合的相關(guān)研究。

據(jù)我們所知，端粒酶、拓撲異構(gòu)酶以及其它細胞內(nèi)的酶之間存在包括協(xié)同作用和拮抗作用等多種聯(lián)系。單一靶點的端粒酶或拓撲異構(gòu)酶抑制劑可能會導致其它酶類一些不可預知的上調(diào)或下調(diào)，其結(jié)果可能會削弱了藥物的抗腫瘤效果。因此，利用釕配合物結(jié)構(gòu)多樣性的優(yōu)勢，對配體部分進行設計和組合，使得單一一個配合物同時擁有拓撲異構(gòu)酶和端粒酶雙重抑制的效果，這將對研究新型抗腫瘤藥物有重要的指導作用。

圖12　可作為端粒酶和拓撲異構(gòu)酶雙重抑制劑的釕多吡啶配合物結(jié)構(gòu)Fig.1　2Structure of ruthenium polypyridyl complexes as dual inhibitors of topoisomerase and telomerase

我們研究組在2015年首次報道了釕(Ⅱ)多吡啶配合物作為靶向拓撲異構(gòu)酶和端粒酶雙重抑制劑的相關(guān)研究。文中報道了3個單核釕(Ⅱ)配合物[Ru(bpy)2 (icip)]2+(42)、[Ru(bpy)2(pdppz)]2+(43)和[Ru(bpy)2(tactp)]2+(44)(圖12)[60]，這一系列配合物擁有較強的誘導和穩(wěn)定人端粒G-四鏈體DNA的能力，對端粒酶的抑制IC50均在納摩爾數(shù)量級，同時也存在對拓撲異構(gòu)酶的抑制活性，IC50在微摩爾數(shù)量級，機理實驗表明[Ru(bpy)2(icip)]2+是TopoⅠ的毒劑,而[Ru(bpy)2(pdppz)]2+和[Ru(bpy)2(tactp)]2+則是TopoⅠ/Ⅱ的雙重毒劑。此外，通過ICP-MS實驗，說明配合物進入細胞后主要在細胞核內(nèi)發(fā)生富集，這也為配合物可以在細胞內(nèi)抑制端粒酶和拓撲異構(gòu)酶提供了依據(jù)。

4　研究展望

金屬配合物，尤其是鉑類藥物用于抗腫瘤的研究，已取得了相對令人矚目的成功，但同時也面臨許多問題。目前，對于除了鉑類抗腫瘤藥物的其它金屬配合物的抗腫瘤活性研究受到越來越多的重視，而其中，釕配合物因其有與鉑類配合物不同的作用機理以及較低的毒性，引起了人們的廣泛興趣。雖然已有很多釕配合物被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性，但是與傳統(tǒng)的鉑類藥物共價結(jié)合DNA的機理并不盡相同，它們中許多抗腫瘤的機制也尚不明確，這也給我們提供了許多新的研究方向。跳出傳統(tǒng)的研究思路框架，配合物與DNA的相互作用除了直接引起DNA復制受阻之外，還將隨之帶來多種細胞核內(nèi)酶活性的變化。其中，針對細胞核內(nèi)的拓撲異構(gòu)酶和端粒酶的相關(guān)研究是目前的一個熱點。目前已有的一些有機小分子被證實通過抑制拓撲異構(gòu)酶或端粒酶取得了很好的抗腫瘤活性，因此，通過利用釕配合物的優(yōu)勢，結(jié)合目前已有的一些酶抑制劑結(jié)構(gòu)特點，開發(fā)新型的金屬配合物拓撲異構(gòu)酶和端粒酶抑制劑的研究具有廣闊的前景，這也有利于對金屬配合物的抗腫瘤機制進行相關(guān)研究。這方面研究工作的開展對設計和研發(fā)新一代作為細胞核內(nèi)酶抑制劑的金屬配合物抗腫瘤藥物有著非常重要的意義。

[1]Jamieson E J,Lippard S J.Chem.Rev.,1999,99:2467-2498

[2]Van Zutphen S,Reedijk J.Coord.Chem.Rev.,2005,249: 2845-2853

[3]Fuertes M A,A lonso C,Pérez J M.Chem.Rev.,2003,103: 645-662

[4]Kelland L.Nat.Rev.Cancer,2007,7:573-584

[5]Kostova I.Curr.Med.Chem.,2006,13:1085-1107

[6]Clark M J.Coord.Chem.Rev.,2002,232:69-93

[7]Bergamo A,Sava G.Dalton Trans.,2007:1267-1272

[8]CHEN Yu(陳禹),DU Ke-Jie(杜可杰),CHAO Hui(巢暉), et al.Prog.Chem.(化學進展),2009,5:836-844

[9]Wang J C.Annu.Rev.Biochem.,1996,65:635-692

[10]QIAN Chen(錢晨),PENG Zai-Li(彭再利),CHAO Hui (巢暉).Univ.Chem.(大學化學),2014,29:1-10

[11]Li T K,Liu L F.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,2001,41: 53-77

[12]Malonne H,Atassi G.Anti.Cancer Drugs,1997,8:811-822

[13]John L N.Nat.Rev.Cancer,2009,9:338-350

[14]MO Xiao-Mei(莫曉媚),LI Jing(李靜),GENG Mei-Yu (耿美玉).Chinese Pharmaco.Bull.(中國藥理學通報), 2007,1:20-23

[15]Gopal Y N V,Jayaraju D,Kondapi A K.Biochemistry,1999, 38:4382-4388

[16]Gao F,Chao H,Wang J Q,et al.J.Biol.Inorg.Chem.,2007, 12:1015-1027

[17]Gao F,Chao H,Zhou F,et al.J.Inorg.Biochem.,2008,102: 1050-1059

[18]EderJP,ChanV,WongJ,etal.CancerChemother.Pharmacol., 1998,42:327-335

[19]Crump M,Lipton J,Hedley D,et al.Leukemia,1999,13: 343-347

[20]Vey N,Kantarjian H,Beran M,et al.Invest.New Drugs, 1999,17:89-95

[21]Azarova A M,Lyu Y L,Lin C P,et al.Proc.Natl.Acad. Sci.USA,2007,107:11014-11019

[22]Du K J,Wang J Q,Kou J F,et al.Eur.J.Med.Chem., 2011,46:1056-1065

[23]Kou J F,Qian C,Wang J Q,et al.J.Biol.Inorg.Chem., 2012,17:81-96

[24]Wang Y C,Qian C,Peng Z L,et al.J.Inorg.Chem.,2014, 130:15-27

[25]Du K J,Liang J W,Wang Y,et al.Dalton Trans.,2014,43: 17303-17316

[26]Zhang P Y,Wang J Q,Huang H Y,et al.Dalton Trans., 2013,42:8907-8917

[27]He X J,Jin L H,Tan L F.Spectrochim.Acta A,2015,135: 101-109

[28]He X J,Zeng L L,Yang G,et al.Inorg.Chim.Acta,2013, 408:9-17

[29]Liu X W,Zhang S B,Li L,et al.Organomet.Chem.,2013, 729:1-8

[30]Liu Y J,Zeng C H,Yao J H,et al.Chem.Biodivers.,2010, 7:1770-1783

[31]Liu Y J,Zeng C H,Huang H L,et al.Eur.J.Med.Chem., 2011,45:564-571

[32]Blackburn E H.J.Biol.Chem.,1990,265:5919-5921

[33]Blackburn E H.Annu.Rev.Biochem.,1984,53:163-194

[34]Blackburn E H.Nature,2000,408,53-56

[35]Liu D,OConnor M S,Qin J,et al.J.Biol.Chem.,2004, 279,51338-51342

[36]Hiyama K,Hiyama E,Ishioka S,et al.J.Natl.Cancer Inst., 1995,87:895-902

[37]Counter C M,Hirte H W,Bacchetti S,et al.Proc.Natl. Acad.Sci.USA,1994,91:2900-2904

[38]Hiyama E,Yokoyama T,Tatsumoto N,et al.Cancer Res., 1995,55:3258-3262

[39]Hiyama E,Gollahon L,Kataoka T,et al.J.Natl.Cancer Inst.,1996,88:116-122

[40]Burge S,Parkinson G N,Hazel P,et al.Nucleic Acids Res., 2006,34:5402-5415

[41]Monchaud D,Teulade-Fichou M P.Org.Biomol.Chem.,2008, 6:627-636

[42]Shay J W,Wright W E.Nat.Rev.Drug Discov.,2006,5: 577-584

[43]Shi S,Liu J,Yao T M,et al.Inorg.Chem.,2008,47:2910-2912

[44]Xu L,Liao G L,Chen X,et al.Inorg.Chem.Commun., 2010,13:1050-10053

[45]Chen X,Wu J H,Lai Y W,et al.Dalton Trans.,2013,42: 4386-4397

[46]Liao G L,Chen X,Wu J H,et al.Dalton Trans.,2014,43: 7811-7819

[47]Xu L,Chen X,Wu J H,et al.Chem.Eur.J.,2015,21:4008-4020

[48]Yu Q Q,Liu Y N,Xu L,et al.Eur.J.Med.Chem.,2014, 82:82-95

[49]Zhang J N,Yu Q Q,Li Q,et al.J.Inorg.Biochem., 2014,134:1-11

[50]Li Q,Zhang J N,Yang L C,et al.J.Inorg.Biochem.,2014, 130:122-129

[51]Xia Y,Chen Q C,Qin X Y,et al.New J.Chem.,2013,37: 3706-3715

[52]Li Q,Sun D D,Zhou Y H,et al.Inorg.Chem.Commun., 2012,20:142-146

[53]Yu Q Q,Liu Y Y,Zhang J N,et al.Metallomics,2013,5: 222-231

[54]Sun D D,Zhang R,Yuan F,et al.Dalton Trans.,2012,41: 1734-1741

[55]Yu Q Q,Liu Y N,Wang C,et al.PloS one,2012,7:e50902

[56]Sun D D,Liu Y N,Liu D,et al.Chem.Eur.J.,2012,18: 4285-4295

[57]Shi S,Gao S N,Cao T C,et al.PloS one,2013,8:e84419

[58]Kim M Y,Duan W,Guzman M G,et al.J.Med.Chem.,2003, 46:571-583

[59]Von S T,Seng H L,Lee H B,et al.J.Biol.Inorg.Chem., 2012,17:57-69

[60]Liao G L,Chen X,Wu J H,et al.Dalton Trans.,2015,DOI: 10.1039/c4dt03585b

New Trends of Ruthenium Complexes as Inhibitors Targeting Topoisomerase and Telomerase

CHEN XiangCHAO Hui＊JI Liang-Nian＊
(MOE Laboratory of Bioinorganic and Synthetic Chemistry,School of Chemistry and Chemical Engineering, Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510275,China)

The anti-tumor study of metal complexes,especially the platinum-base drugs,has achieved remarkable success but still facing several problems such as drugs resistance and side effects.Recently,ruthenium complexes attract many scientists′interests with their brand new application of anti-tumor drugs.In the series of nonplatinum drugs,ruthenium complexes are regarded as one of the most potential anti-tumor drugs for the reason not merely the metal ruthenium and its complexes exhibit low toxicity but also they can be efficiently absorbed and excreted for human body.Herein,the study of the follow-up inhibition towards nucleus enzymes induced by the binding between ruthenium complexes and DNA was expatiated,introducing the advance anti-tumor applications of ruthenium complexes in new perspectives.

ruthenium complexes;topoisomerase;G-quadruplex;telomerase

O614.82+1

A

1001-4861(2015)09-1667-11

10.11862/CJIC.2015.241

2015-05-20。收修改稿日期：2015-07-15。

973項目(No.2015CB85630)、國家自然科學基金(No.21172273，21171177，21471164)和教育部高校博士點基金博導類課題(No.20110171110013)資助項目。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：ceschh@mail.sysu.edu.cn，cesjln@mail.sysu.edu.cn；會員登記號：S06N4211M1006。