楊靜??尹娜娜??苗愛東

[摘要] 目的 建立呋柳擦劑的微生物限度檢查方法。 方法 制備供試液時加入了聚山梨酯80，并與未加聚山梨酯80供試液的驗證結(jié)果相比較。 結(jié)果 未加聚山梨酯80的供試液存在抑菌活性，而加入15g聚山梨酯80的供試液，采用培養(yǎng)基稀釋法各試驗菌的回收率均>70%。 結(jié)論 呋柳擦劑可采用加入聚山梨酯80的供試液制備方法進行微生物限度檢查。

[關(guān)鍵詞] 呋柳擦劑；聚山梨酯80；微生物限度檢查；方法驗證

[中圖分類號] R927.1 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）17-48-03

Research on test methods of microorganism limit of Fu Liu liniment

YANG Jing YIN Nana MIAO Aidong

Beijing Military Region Joint Logistics Department Drug and Instrument Test Institute，Beijing 100071，China

[Abstract] Objective Establish microorganism limit test of Fu Liu Liniment. Methods Add Polysorbate 80 when preparing test solution，and compare the test result with the test solution without Polysorbate 80. Results Antibacterial activities appeared in the test solution without Polysorbate 80，but for the one with 15g Polysorbate 80，the recovery rate of every tested microorganisms is larger than 70%. Conclution We can conduct microorganism limit test of Fu Liu Liniment by adding Polysorbate 80.

[Key words] Fu Liu liniment；Polysorbate 80；Microorganism limit test；Method validation

呋柳擦劑為皮膚病外用制劑，由水楊酸、苯甲酸、鞣酸和呋喃西林等成分組成，本品具有抑制真菌、止癢等作用，主要用于手足癬和體癬等各種皮膚癬癥的治療。按常規(guī)方法制備供試液時，制劑中的主要化學(xué)成分存在明顯的抑菌活性，難以確保試驗結(jié)果的可靠性[1-5]。供試品加入15g聚山梨酯80混勻后再加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液制備的供試液為澄清的液體，采用培養(yǎng)基稀釋法各試驗菌的回收率均大于70%。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HTY-2000 集菌儀（杭州泰林醫(yī)療器械廠）；GH-6000隔水式培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）；LRH-250-MS霉菌培養(yǎng)箱（韶關(guān)泰宏醫(yī)療器械有限公司）；DF3-3紅外線高溫干燥箱（北京興爭儀器設(shè)備廠）；LDZX立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 菌種

驗證用試驗菌種均購于中國藥品生物制品檢定所，包括：大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]；白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。

1.3 培養(yǎng)基

玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號分別為1312192、131218、131016、120113、1309122、140110、140124）均購于中國藥品生物制品檢定所；聚山梨酯80（上海申宇醫(yī)藥化工有限公司）；呋柳擦劑（批號：20120917、20130312、20130313）。

2 試驗方法與結(jié)果

按照《中國藥典》2010年版，第一部[4]附錄XⅢ C微生物限度檢查法進行驗證試驗。

2.1 菌液制備

2.1.1 將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌，分別接種至10mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24h，分別取上述培養(yǎng)物1mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，制成每1mL含菌數(shù)約為50～100cfu的菌液，備用。用于控制菌檢查時，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，制成每1mL含菌數(shù)約為10～100cfu的菌液，備用。

2.1.2 將白色念珠菌接種至10mL改良馬丁培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)24h，取上述培養(yǎng)物1mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，制成每1mL含菌數(shù)約為50～100cfu的菌液，備用。

表1 常規(guī)法的回收率試驗結(jié)果（%）

組別 大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌 枯草芽胞桿菌 白色念珠菌 黑曲霉

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

A組 61 60 64 23 24 26 0 0 0 92 91 90 87 90 85

B組 98 90 93 100 103 99 28 29 26 92 93 95 90 93 92

C組 98 100 102 100 100 96 98 96 100 100 99 100 95 100 100

表2 培養(yǎng)基稀釋法的回收率試驗結(jié)果（%）

組別 大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌 枯草芽胞菌 白色念珠菌

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

A組 96 90 94 23 25 26 0 0 0

57 55 60 0 0 0

B組 88 80 86

2.1.3 將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)5～7d，有大量的孢子產(chǎn)生，加入5mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管中，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，制成含菌數(shù)約為50～100cfu/mL的孢子懸液，備用。

2.2 供試液的制備

A組：取呋柳擦劑10mL，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，搖勻，制成1∶10的供試液；B組：取呋柳擦劑10mL，加入15g聚山梨酯80混勻后再加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，搖勻，制成1∶10的供試液；C組：取15g聚山梨酯80加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，搖勻，作為稀釋劑對照組。

2.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證

2.3.1 試驗組 （1）常規(guī)法：取1mL供試液和50～100cfu試驗菌，注入平皿中，每皿加15～20mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻、培養(yǎng)、觀察結(jié)果。（2）培養(yǎng)基稀釋法：分別取0.5和0.2mL的供試液和50～100cfu試驗菌，注入平皿中，每皿加15～20mL 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻、培養(yǎng)、觀察結(jié)果。各試驗菌株的回收率結(jié)果，見表l。

2.3.2 菌液組 取50～100cfu試驗菌，注入平皿中，每皿加15～20mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻、培養(yǎng)、觀察結(jié)果。

2.3.3 供試品對照組 （1）常規(guī)法：取1mL供試液，注入平皿中，每皿加15～20mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻、培養(yǎng)、觀察結(jié)果。（2）培養(yǎng)基稀釋法：分別取0.5和0.2mL的供試液，注入平皿中，每皿加15～20mL 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻、培養(yǎng)、觀察結(jié)果。

2.3.4 稀釋劑對照組 （1）常規(guī)法：取1Ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液和50～100cfu試驗菌，注入平皿中，每皿加15～20mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻、培養(yǎng)、觀察結(jié)果。（2）培養(yǎng)基稀釋法：分別取0.5和0.2mL的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液和50～100cfu試驗菌，注入平皿中，每皿加15～20mL l營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻、培養(yǎng)、觀察結(jié)果。

2.3.5 試驗組回收率（%）=[（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)]×100%。

從表1的回收率試驗結(jié)果可以看出：采用常規(guī)法，A組對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的回收率均<70%，對枯草芽胞桿菌的回收率為0，說明制劑中的成分有顯著的抑菌作用。B組僅對枯草芽胞桿菌的回收率<70%，因此，先選擇培養(yǎng)基稀釋法測定各抑菌菌株的回收率，見表2。

從表2的回收率試驗結(jié)果可以看出：A組采用0.2mL皿供試液的培養(yǎng)基稀釋法后，對金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的回收率仍低于70%。B組采用0.5mL/皿供試液的培養(yǎng)基稀釋法后，對枯草芽胞桿菌的回收率即達(dá)到了70%，說明加入的15g聚山梨酯80 起到了中和抑菌性的作用。

2.4 控制菌檢查方法的驗證

呋柳擦劑為外用溶液劑，按照《中國藥典》2010年版，第二部[6]規(guī)定，控制菌應(yīng)檢查金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

2.4.1 金黃色葡萄球菌 試驗組：（1）常規(guī)法：取1∶10的供試液10mL和含菌數(shù)約為10～100cfu的金黃色葡萄球菌，加入到100mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中。（2）培養(yǎng)基稀釋法：取1∶10的供試液10mL和金黃色葡萄球菌10～100cfu，加入到200 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中。

供試品組：除不加金黃色葡萄球菌外，其余操作同試驗組。

陽性對照組：除不加供試液外，其余操作同試驗組。

陰性對照組：用稀釋液代替供試液，其余操作同試驗組。

2.4.2 銅綠假單胞菌 試驗組：（1）常規(guī)法：取1∶10的供試液10mL和含菌數(shù)約為10～100cfu的銅綠假單胞菌，加入到100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。（2）培養(yǎng)基稀釋法：取1∶10的供試液10mL和銅綠假單胞菌10～100cfu，加入到200mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。

供試品組：除不加銅綠假單胞菌外，其余操作同試驗組。

陽性對照組：除不加供試液外，其余操作同試驗組。

陰性對照組：用稀釋液代替供試液，其余操作同試驗組?？刂凭鷻z查方法的驗證結(jié)果，見表3。

表3 控制菌檢查方法的驗證結(jié)果

藥品名稱 金黃色葡萄球菌 銅綠假單胞菌

常規(guī)法 稀釋法 常規(guī)法 稀釋法

A組 - - - +

B組 - + + /

注：表中“+”代表該反應(yīng)呈陽性，“-”代表該反應(yīng)呈陰性。

2.5 微生物限度檢查方法的驗證結(jié)果

2.5.1 計數(shù)方法的驗證結(jié)果 通過驗證試驗，采用0.5mL/皿供試液的培養(yǎng)基稀釋法即能有效去除其抑菌作用，使回收率均達(dá)到70%以上。

2.5.2 控制菌檢查方法的驗證結(jié)果 呋柳擦劑采用培養(yǎng)基稀釋法檢查金黃色葡萄球菌，采用常規(guī)法檢查銅綠假單胞菌。

3 討論

呋柳擦劑含水楊酸、苯甲酸、鞣酸和呋喃西林等成分，在10mL供試品中直接加入稀釋劑制成的供試液，對試驗菌有較強的抑菌性。當(dāng)制備供試液時先將10mL供試品與15g聚山梨酯80混合后，再加入稀釋劑制成的供試液，能有效去除其抑菌作用，方法簡單、快速，節(jié)約成本，科學(xué)可靠。聚山梨酯80是非離子型表面活性劑，具有乳化、增溶和穩(wěn)定的作用，一方面增加了藥品的溶解性，另一方面對微生物有保護作用[7-11]，通過試驗證明，聚山梨酯80對試驗菌株無抑菌性，不會對微生物造成損傷[12-16]。在供試品中添加聚山梨酯80可有效地降低其抑菌性，但由于不同的供試品抑菌性不同，抑菌性強需要其濃度高，可在試驗中適當(dāng)調(diào)節(jié)。試驗中發(fā)現(xiàn)，在制備供試液時應(yīng)充分搖勻，使供試品在稀釋劑中分散均勻，確保試驗的重復(fù)性和可靠性。

[參考文獻]

[1] 高新貞，陳靜，白秀萍.藥品微生物限度檢查驗證方法在保健品中的應(yīng)用研究[J].食品與藥品，2010，20（11）：433-436.

[2] 陳曉梅.國玉傷痛寧軟膏微生物限度檢查方法的建立[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)（學(xué)術(shù)版），2008，2（20）：35-36.

[3] 陸益萍.3種軟膏劑的微生物限度檢查驗證[J].安徽醫(yī)藥，2008，12（4）：318-319.

[4] 李喜梅.皮膚創(chuàng)面誘導(dǎo)凝膠微生物限度檢查驗證[J].海峽藥學(xué)，2015，18（2）：72-73.

[5] 任敬超.含抑菌成分中成藥固體制劑微生物限度檢查驗證方法的建立[J].黑龍江科技信息，2007，11（12）：209.

[6] 國家藥典委員會，中華人民共和國藥典（二部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：107.

[7] 光華，余立.聚山梨酯80和卵磷脂在化學(xué)藥物微生物限度檢查時的中和作用[J].藥物分析雜志，2008，28（7）：1127-1130.

[8] 王魯勤.痛血康膠囊微生物限度檢查驗證實驗[J].海峽藥學(xué)，2009，12（9）：64-65.

[9] 許華玉，杜蕓，錢文靜，等.藥品微生物限度檢查法中細(xì)菌和真菌計數(shù)方法的驗證試驗[J].中國中藥雜志，2005，11（24）：1918-1920.

[10] 馬越，特玉香，杜平華，等.16種中成藥微生物限度檢查法方法驗證[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6（6）：12-15.

[11] 丘展鋒，黃國玉.硝酸咪康唑乳膏微生物限度檢查驗證[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4（16）：153-154.

[12] 林常定.補骨脂酊的微生物限度檢查法[J].中國醫(yī)藥指南，2011，9（21）：255-257.

[13] 楊玲.利福昔明微生物限度檢查驗證方法的建立[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2007，26（11）：1352-1353.

[14] 陳媛，吳楣，藍(lán)紅梅.3種醫(yī)院軟膏劑微生物限度檢查方法學(xué)研究[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2014，4（12）：105-107.

[15] 田英.鹽酸法舒地爾微生物限度檢查驗證[J].中醫(yī)臨床研究，2013，5（20）：103-104.

[16] 潘雯，關(guān)倩明，林玲.7種具有抑菌成分中成藥的微生物限度檢查方法驗證[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2012，28（6）：623-627.

（收稿日期：2015-07-10）