商 群, 陳 新, 王超超, 葛天宇, 曹 瑞, 朱秀琴, 徐利婷, 唐 敏

(1. 海南大學(xué) 材料與化工學(xué)院, 海南 海口 570228； 2. 海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 海南 ?？?570228； 3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 北京 100083)

近年來, 隨著人們對海洋資源的開發(fā)力度不斷加大, 海洋防污問題也越來越嚴(yán)峻。目前化學(xué)防污法特別是防污涂料是最常用的防污技術(shù), 但防污涂料中使用的很多防污劑都具有不同程度的生態(tài)毒性。如有機(jī)錫曾是廣泛使用的高效廣譜防污劑, 但因有機(jī)錫對海洋生態(tài)環(huán)境造成的嚴(yán)重破壞, 已在2008年被禁止用于海洋防污涂料[1]。吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅具有較好的防污效果, 且在海水中見光易分解,在國內(nèi)外作為防污助劑已被大量使用[2-3], 但研究發(fā)現(xiàn)在光照有限的地方則會明顯積累[4], 在越南和日本的船塢沉積物都已檢測到吡啶硫酮銅[5-6]。吡啶酮金屬的海洋生態(tài)毒性方面的研究很少, 以有機(jī)錫為前車之鑒, 因此, 有必要對吡啶酮金屬的生態(tài)毒性進(jìn)行較深入而系統(tǒng)的研究。

多毛類華美盤管蟲(Hydroides elegans)廣泛分布于熱帶和亞熱帶海域[7-9], 是中國南海近岸海域常見的多毛類。其生活史分為營浮游生活的幼蟲期和固著生活的成體期。華美盤管蟲具有生長速度快、性成熟早、幼蟲階段短和附著快速等特點(diǎn)[10-12]。在熱帶海域, 華美盤管蟲全年都能進(jìn)行繁殖, 并且其在實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)及相應(yīng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法也已經(jīng)發(fā)展成熟, 因此是海洋生態(tài)毒理試驗(yàn)研究的理想生物。以往在實(shí)驗(yàn)室中對華美盤管蟲的研究主要集中在其早期發(fā)育[12-13]、海洋酸化對其影響[14-15]、基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)[7,16], 并作為一些防污劑及重金屬檢測的生態(tài)毒理研究生物[17-19]。作者采用中國南海常見物種 ——華美盤管蟲為生態(tài)毒理研究對象, 通過研究吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅對其早期發(fā)育階段的急性毒性效應(yīng),以期為這兩種吡啶硫酮類防污劑在中國南海的生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)和安全使用劑量提供參考資料。1

1 材料和方法

1.1 材料

華美盤管蟲成體采集于海南陵水近岸海域(18°30′N, 110°01′20″E), 常年水溫為 24.5～25.5℃, 平均海水鹽度為33, pH為8.2。

1.2 方法

1.2.1 華美盤管蟲成體的培養(yǎng)

將采集的華美盤管蟲放在玻璃水族箱中短期培養(yǎng), 使用采集地海水。暫養(yǎng)期間連續(xù)充氣, 每日早晚各投餌 1次, 餌料為牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri), 半量換水, 每天1次。

1.2.2 配子的獲取和幼蟲的培養(yǎng)

華美盤管蟲的石灰質(zhì)管被破壞后, 產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng), 常在1 min之內(nèi)就會釋放大量配子[19]。用鑷子輕輕將華美盤管蟲石灰質(zhì)棲管破壞, 取出成體, 用過濾海水(0.45 μm)潤洗后, 于海水中靜置數(shù)分鐘, 即可獲得配子。

培養(yǎng)幼蟲時(shí), 將獲取的卵子和精子按照適宜比例轉(zhuǎn)移到盛有海水的燒杯, 28 ℃條件下培養(yǎng)。每天換水 1次, 投餌 1次, 餌料為球等鞭金藻(Isochrysis galbana)。選取培養(yǎng)24 h的擔(dān)輪幼蟲和72 h的后擔(dān)輪幼蟲進(jìn)行毒理試驗(yàn)。

1.2.3 毒理試驗(yàn)

以二甲基亞砜(華大試劑)為溶劑, 將吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅(≥ 99%, 上海廣拓化學(xué))分別配制成 1000 mg/L的儲存液, 再根據(jù)需要稀釋成相應(yīng)的工作濃度。所有玻璃儀器及海水都經(jīng)過高溫高壓滅菌。試驗(yàn)期間保持溫度28 ℃, 無光照。每一處理組設(shè)平行樣3個(gè), 試驗(yàn)重復(fù)3次。本實(shí)驗(yàn)選取成熟的卵子和精子、培養(yǎng)24 h的擔(dān)輪幼蟲和72 h的后擔(dān)輪幼蟲進(jìn)行毒理試驗(yàn)。各處理組濃度根據(jù)預(yù)試驗(yàn)和等比原則設(shè)置相應(yīng)的毒物濃度范圍。

1.2.3.1 精子毒理試驗(yàn)

分別吸取 500 μL 精子溶液(40 000 個(gè)/μL), 暴露于不同濃度的待檢溶液(5 mL)中, 20 min后分別將處理過的精子溶液1000 μL與200個(gè)未處理的正常卵子混合受精, 60 min后加入20%福爾馬林終止受精, 之后靜置20 min, 然后在顯微鏡下觀察100個(gè)卵子, 計(jì)數(shù)其中卵子受精率。

1.2.3.2 卵子毒理試驗(yàn)

卵子毒理試驗(yàn)過程與精子毒理試驗(yàn)類似。即分別將200個(gè)卵子暴露于不同濃度的測試液中, 20 min后向燒杯中加入100 μL未處理的精子溶液(40 000個(gè)/μL),混合受精。60 min后加入20%福爾馬林終止受精卵繼續(xù)發(fā)育, 靜置20 min后, 在顯微鏡下觀察100個(gè)卵子, 計(jì)數(shù)卵子受精率。

1.2.3.3 擔(dān)輪幼蟲和后擔(dān)輪幼蟲毒理試驗(yàn)

通過在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)獲得擔(dān)輪幼蟲和后擔(dān)輪幼蟲。分別吸取15只幼蟲, 向其中加入4 mL不同濃度的測試液, 分別在暴露24 h和48 h后, 計(jì)數(shù)各組的幼蟲死亡數(shù)量和死亡率。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用 SPSS19.0, 通過概率單位回歸法分析得到半數(shù)抑制濃度(IC50)、半數(shù)致死濃度(LC50)及其 95%置信區(qū)間。配子受精發(fā)育的抑制率P=(Pe-Pc)/(1-Pc)×100%[21], 其中Pe為實(shí)驗(yàn)組未成功受精發(fā)育卵子比例,Pc為空白組未成功受精發(fā)育卵子比例。

2 結(jié)果

華美盤管蟲成熟卵子直徑約為 41 μm。一般在28 ℃, pH 8.1,鹽度35的適宜條件下, 卵子受精后大概在30 min內(nèi)完成第一次分裂, 約50 min完成第二次分裂。受精之后100 min即可達(dá)到64細(xì)胞階段,大概2 h達(dá)到囊胚期, 12 h左右則能發(fā)育到擔(dān)輪幼蟲階段。

2.1 吡啶硫酮對精子的毒性

以可發(fā)生卵裂的受精卵為成功受精的判斷依據(jù),其余未受精及受精但未分裂的卵子則都算作異常。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度處理組之間, 成功發(fā)育比例存在差異(圖1和圖2)。當(dāng)吡啶硫酮銅質(zhì)量濃度為5 μg/L時(shí), 即會對精子活性產(chǎn)生抑制作用, 此濃度對受精抑制率為6.25%； 質(zhì)量濃度為50 μg/L時(shí), 受精抑制率達(dá)到96.88%, 其IC50為19.49μg/L； 吡啶硫酮鋅質(zhì)量濃度為 10 μg/L時(shí), 抑制率為 12.63%, 質(zhì)量濃度為100 μg/L時(shí)抑制率為95.79%, 其IC50為36.74 μg/L(表 1)。

圖1 吡啶硫酮銅對華美盤管蟲精子的毒性效應(yīng)Fig. 1 Toxic effect of copper pyrithione on sperm of Hydroides elegans

表1 吡啶硫酮類防污劑對華美盤管蟲不同時(shí)期的IC50、LC50及其95%置信區(qū)間Tab.1 IC50, LC50 values and the 95% confidence intervals of metal pyrithione on Hydroides elegans

圖2 吡啶硫酮鋅對華美盤管蟲精子的毒性效應(yīng)Fig. 2 Toxic effect of zinc pyrithione on sperm of Hydroides elegans

2.2 吡啶硫酮對卵子的毒性

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為 25 μg/L的吡啶硫酮銅對卵子受精過程會產(chǎn)生抑制作用, 抑制率為2.06%, 當(dāng)質(zhì)量濃度為 200 μg/L時(shí), 抑制率達(dá)到 98.97%, 其IC50為 88.44 μg/L； 吡啶硫酮鋅質(zhì)量濃度 50 μg/L 時(shí),抑制率為5.32%, 當(dāng)質(zhì)量濃度為400 μg/L時(shí), 抑制率為 97.87%, 其 IC50為 159.59 μg/L(圖 3 和圖 4)。

圖3 吡啶硫酮銅對華美盤管蟲卵子的毒性效應(yīng)Fig.3 Toxic effect of copper pyrithione on eggs of Hydroides elegans

圖4 吡啶硫酮鋅對華美盤管蟲卵子的毒性效應(yīng)Fig. 4 Toxic effect of zinc pyrithione on eggs of Hydroides elegans

2.3 吡啶硫酮對擔(dān)輪幼蟲的毒性

當(dāng)擔(dān)輪幼蟲分別暴露于 1.0 μg/L的吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅時(shí), 幼蟲死亡率與對照組無明顯差異。暴露于25 μg/L吡啶硫酮銅, 24 h和48 h擔(dān)輪幼蟲的死亡率為100%, 24 h和48 h 的LC50分別為7.35 μg/L和5.00 μg/L； 當(dāng)吡啶硫酮鋅質(zhì)量濃度為50 μg/L時(shí),暴露時(shí)間在24 h和48 h的擔(dān)輪幼蟲的死亡率都達(dá)到了100%, 24 h和48 h的 LC50分別為8.57 μg/L和6.67 μg/L (圖 5 和圖 6)。

2.4 吡啶硫酮對后擔(dān)輪幼蟲的毒性

后擔(dān)輪幼蟲分別暴露于 1.0 μg/L吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅時(shí), 幼蟲死亡率與對照組無顯著差異。吡啶硫酮銅在 25 μg/L時(shí), 后擔(dān)輪幼蟲在暴露時(shí)間為24 h和48 h時(shí)的死亡率均為100%,24 h 和 48 h 的 LC50分別為 8.57 μg/L 和 5.87 μg/L；吡啶硫酮鋅質(zhì)量濃度在50 μg/L時(shí), 后擔(dān)輪幼蟲在24 h和48 h的死亡率都為100%, 24 h和48 h的 LC50分別為 12.03 μg/L 和 8.07 μg/L(圖 7 和圖 8)。

圖5 吡啶硫酮銅對華美盤管蟲擔(dān)輪幼蟲的毒性效應(yīng)Fig. 5 Toxic effect of copper pyrithione on trochophore of Hydroides elegans

圖6 吡啶硫酮鋅對華美盤管蟲擔(dān)輪幼蟲的毒性效應(yīng)Fig. 6 Toxic effect of zinc pyrithione on trochophore of Hydroides elegans

圖7 吡啶硫酮銅對華美盤管蟲后擔(dān)輪幼蟲的毒性效應(yīng)Fig. 7 Toxic effect of copper pyrithione on metatroch of Hydroides elegans

3 討論

圖8 吡啶硫酮鋅對華美盤管蟲后擔(dān)輪幼蟲的毒性效應(yīng)Fig. 8 Toxic effect of zinc pyrithione on metatroch of Hydroides elegans

多毛類種類繁多, 分布廣泛, 在很多海域的底棲生物群落中約占 30%～80%, 在海洋沉積與水體之間的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換過程中起著重要作用。此外, 一些多毛類對海洋污染物較敏感, 易在實(shí)驗(yàn)室人工培育, 因此被選為生態(tài)毒理研究和毒性檢測的被檢生物[10,20,22]。華美盤管蟲的早期生命階段能對重金屬如汞、鎘等表現(xiàn)出較高的敏感性[19], 其配子及幼蟲在熱帶和亞熱帶地區(qū)全年都能夠獲得, 因此在中國南海海洋生態(tài)毒理研究方面, 華美盤管蟲作為被檢生物具有一定優(yōu)勢。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 與吡啶硫酮鋅相比, 吡啶硫酮銅對華美盤管蟲的早期生命階段普遍表現(xiàn)出更高的毒性。華美盤管蟲精子對兩種吡啶硫酮類防污劑的毒性的敏感性高于卵子。隨著暴露時(shí)間的延長, 幼蟲對兩種毒物的敏感性明顯提高。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明華美盤管蟲擔(dān)輪幼蟲階段對吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅毒性作用的敏感性顯著(P＞0.05)高于后擔(dān)輪幼蟲階段?？赡茈S著華美盤管蟲幼蟲發(fā)育逐漸成熟, 對吡啶硫酮類防污劑的抗毒或解毒能力也相應(yīng)提高。

無脊椎動(dòng)物對吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅毒性的敏感性差異較大, 紋藤壺腺介幼蟲 24 h-LC50分別為 11和 29 μg/L, 鬼手海葵96 h-LC50則分別為2000和410 μg/L, 日本虎斑猛水蚤96h-LC50分別為30和170 μg/L[17], 相比較下, 華美盤管蟲幼蟲的敏感性更高。

吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅對華美盤管蟲毒性要高于無機(jī)重金屬銅(無機(jī)銅對擔(dān)輪幼蟲 48 h-LC50為100 μg/L, 而吡啶硫酮銅為 5.00 μg/L)和鋅(暴露于無機(jī)鋅的華美盤管蟲精子和卵子的受精 IC50分別為945.31 μg/L和 2025.63 μg/L, 遠(yuǎn)高于吡啶硫酮鋅的36.74 μg/L 和 159.59 μg/L)[17,19]。

研究表明吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅會破壞細(xì)菌細(xì)胞生物膜和膜兩側(cè)的pH梯度, 也能與細(xì)胞內(nèi)的金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合, 從而破壞細(xì)胞中ATP的合成,并造成一些金屬離子的缺乏[23]。此外, 吡啶硫酮類防污劑會影響無脊椎動(dòng)物的一些酶體系和相關(guān)蛋白表達(dá), 發(fā)現(xiàn)暴露于吡啶硫酮銅的多齒維沙蠶(Perinereis nuntia), 在質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí), 其十六烷酰輔酶A活性在 3 h內(nèi)急速下降, 之后維持較低水平不變；在質(zhì)量濃度為32 mg/L時(shí), 二磷酸尿核苷-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性在24 h內(nèi)先急速下降, 之后緩慢降低[24],當(dāng)吡啶硫酮鋅濃度為0.2 μmol/L時(shí)即會引起紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)鰓部和消化腺熱休克蛋白過度表達(dá), 造成基因損傷[25]。相比于這些生物指標(biāo),華美盤管蟲配子和幼蟲對吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅具有更高的敏感性, 而且檢測方法經(jīng)濟(jì)、簡單易行、重復(fù)性好, 在海洋生態(tài)環(huán)境評價(jià)和環(huán)境監(jiān)測中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

可見, 吡啶硫酮銅和吡啶硫酮鋅對多種海洋生物具有較明顯的毒性作用, 對這兩種吡啶硫酮類防污劑的使用量需更加慎重。同時(shí), 吡啶硫酮類防污劑的作用機(jī)理以及在食物鏈中的傳遞過程都需進(jìn)一步的研究。

致謝：海南大學(xué)分析測試中心。

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