藺 露 董春霞 孫 燕 徐 璐 王 琴

(1.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401120；2.中國獸醫(yī)藥監(jiān)察所,北京 100081)

采用不同ELISA試劑盒對豬瘟抗體水平調(diào)查結(jié)果的影響

藺 露1董春霞1孫 燕1徐 璐2王 琴2

(1.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401120；2.中國獸醫(yī)藥監(jiān)察所,北京 100081)

本文采用豬瘟抗體間接ELISA和阻斷ELISA檢測試劑盒對320份血清樣本進(jìn)行豬瘟抗體檢測，符合率達(dá)80.63%，對檢測結(jié)果不一致的樣品，利用抗體中和試驗(yàn)（FVNT）做定性檢測，結(jié)果表明，間接ELISA試劑盒的敏感性和特異性均高于阻斷ELISA試劑盒，豬瘟間接ELISA試劑盒更適用于我國豬瘟抗體檢測。

豬瘟 抗體中和試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附法

豬瘟又稱經(jīng)典豬瘟（Classical Swine Fever，CSF），是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一類高度接觸性傳染病，是世界糧農(nóng)組織和各國政府密切關(guān)注的主要傳染病之一[1]。國際獸醫(yī)局（OIE）將其列為必須上報的傳染病。20世紀(jì)50年代，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的周泰沖研究員等開發(fā)了豬瘟兔化弱毒疫苗株，該疫苗免疫原性好，安全性高，包括中國在內(nèi)的世界各國采用該疫苗成功的控制了豬瘟大范圍流行[2]。我國目前對豬瘟的防控采取疫苗全群免疫策略，因此，豬瘟抗體水平監(jiān)測就成為評價疫苗免疫效果的主要手段。目前我國用于豬瘟抗體水平檢測的主要有抗體中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和正向間接血凝方法等。而國際上推薦的方法主要為抗體中和試驗(yàn)和ELISA方法[3]。本研究對采集的320份血清樣本用兩種不同的ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，然后對兩種試劑盒檢測結(jié)果有差異的血清用抗體中和試驗(yàn)進(jìn)行定性檢測，比較兩種試劑盒的檢測結(jié)果，為最終篩選適合我國田間大范圍推廣應(yīng)用的試劑盒提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

（1）豬瘟病毒Thiveral株、豬瘟病毒熒光抗體、PK15傳代細(xì)胞系：由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定，保存并提供。

（2）豬瘟病毒間接E L ISA抗體檢測試劑盒（簡稱“I-ELISA”）：由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號為20121115。

（3）豬瘟抗體檢測試劑盒（簡稱“B-ELISA”）：購自美國IDEXX公司。

（4）血清：采自重慶市境內(nèi)5個區(qū)縣的規(guī)模場、種豬場及散養(yǎng)戶，共計(jì)320頭份。其中，免疫血清250頭份，非免疫仔豬血清70頭份。

1.2 方法

1.2.1 ELISA試劑盒檢測 將上述320頭份血清用I-ELISA和B-ELISA試劑盒進(jìn)行同步檢測，每份血清檢測2個重復(fù)。操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 抗體中和試驗(yàn)檢測 本研究中采用豬瘟病毒的單克隆熒光抗體進(jìn)行中和試驗(yàn)（Fluorescent antibody virus neutralization test，F(xiàn)VNT）。

2 結(jié)果

2.1 臨床血清樣本的I-ELISA和B-ELISA檢測結(jié)果及比較（見表1）

表1 兩種試劑盒對臨床血清的檢測結(jié)果

2.2 不同ELISA試劑盒對不同免疫背景血清的檢測結(jié)果（見表2）

表2 兩種試劑盒對不同背景血清的檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

2.3 FVNT對兩種試劑盒檢測結(jié)果

不一致的有62份（除1份血清的余量不足外）均進(jìn)行了FVNT檢測，結(jié)果見表3和表4。

表3 I-ELISA與FVNT的檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

表4 I-ELISA與FVNT的檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

3 討論

3.1 豬瘟抗體檢測方法的選擇

在進(jìn)行豬瘟抗體檢測時，OIE推薦的方法為抗體中和試驗(yàn)和ELISA方法。抗體中和試驗(yàn)根據(jù)抗體標(biāo)記物的不同又可分為過氧化物酶中和試驗(yàn)（Neutralising peroxidase-linked assay，NPLA）和熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（Fluorescent antibody virus neutralization test，F(xiàn)VNT）。抗體中和試驗(yàn)的原理是將待檢血清與一定量的豬瘟病毒混合孵育后接種敏感細(xì)胞，根據(jù)病毒對細(xì)胞的感染情況對待檢血清抗體效價進(jìn)行測定。該方法主要檢測中和抗體，但操作復(fù)雜，耗時長（大于3d），且實(shí)驗(yàn)條件要求高，檢測通量小，并不適合在基層使用。而臨床上常見的是采用ELISA血清學(xué)的檢測方法對豬瘟抗體進(jìn)行檢測。

3.2 不同種類ELISA試劑盒的選擇

檢測豬瘟抗體的ELISA試劑盒中，主要分為兩類：間接ELISA和阻斷ELISA。間接ELISA是將純化的豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白包被在反應(yīng)板中，加入待檢血清后，血清中的特異性抗體會與包被抗原發(fā)生結(jié)合，通過辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行顯色，反應(yīng)孔的顏色反應(yīng)強(qiáng)度與特異性抗體的量成正比。阻斷ELISA也是包被豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白，加入待檢血清后，陽性抗體會與包被蛋白上的特定表位結(jié)合并封閉，使之后加入的酶標(biāo)單抗無法結(jié)合到該表位上，從而起到了阻斷作用，反應(yīng)孔的顏色反應(yīng)強(qiáng)度與特異性抗體含量成反比[4]。本研究中選擇的豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒（即I-ELISA）采用的是間接ELISA 原理，而進(jìn)口的豬瘟抗體檢測試劑盒（即“B-ELISA”）采用的是阻斷ELISA原理，通過對這兩種試劑盒的檢測效果進(jìn)行比較，結(jié)果證明，在對田間樣本進(jìn)行檢測時，豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒的敏感性和特異性均高于豬瘟抗體檢測試劑盒。

3.3 不同免疫豬群的免疫效果存在差異

對不同地區(qū)、不同來源的豬血清樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，I-ELISA檢測種豬場免疫血清的陽性率最高，分別為100%和97.5%，而規(guī)?；i場的陽性率在不同地區(qū)呈現(xiàn)不同的水平；B-ELISA檢測種豬場免疫血清的陽性率偏低，分別為70%和92.5%，而規(guī)?；i場的陽性率也有很大差異。通過兩種試劑盒的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的豬群免疫水平存在差異，而且選擇不同試劑盒對抗體水平檢測結(jié)果也有很大影響。將檢測結(jié)果存在差異的血清進(jìn)行FVNT定性檢測后發(fā)現(xiàn)，I-ELISA與FVNT的符合率為70.49%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出B-ELISA。其他研究也證明[5]，I-ELISA試劑盒的準(zhǔn)確性更高。

[1] 殷震.動物病毒學(xué)[M].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1996.

[2] 涂長春.豬瘟國際流行態(tài)勢、我國現(xiàn)狀及防制對策[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（8）：955-960.

[3] 世界動物衛(wèi)生組織.陸生動物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊（哺乳動物、禽鳥與蜜蜂）[M].農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局/中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，2004.

[4] John R. Crowther，the ELISA guide book[M].2001，Humana Press.

[5] 徐璐，范學(xué)政，徐和敏，等.豬瘟抗體間接ELISA檢測試劑盒的研制和應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)雜志，2012，48（9）：21-24.

藺露（1983-），女，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物疫病實(shí)驗(yàn)室診斷及研究。

藺露