榮海博 趙穎 俞麗娟 管樺

(公安部第一研究所 北京 100048)

毛細(xì)管電泳是80年代后期迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)新的電泳分離技術(shù),其具有DNA樣品加樣自動(dòng)化、高效快速、定量準(zhǔn)確及樣品用量微量等優(yōu)點(diǎn)?；诿?xì)管凝膠電泳-激光激發(fā)熒光技術(shù)研制的DNA測(cè)序儀已成為法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的常規(guī)檢驗(yàn)儀器[1]。

DNA測(cè)序儀由中央控制系統(tǒng)、注膠系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)控制平臺(tái)、溫度控制系統(tǒng)、毛細(xì)管高壓電泳系統(tǒng)和數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)組成,只有當(dāng)每個(gè)系統(tǒng)保持良好的運(yùn)行狀態(tài)以及各系統(tǒng)之間良好的相互協(xié)調(diào),才能獲得完整且正確DNA檢驗(yàn)結(jié)果[2]。如下圖所示：

因此,本文根據(jù)以往的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料從DNA測(cè)序儀的空間校正、光譜校正、電泳過程監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)、單堿基分辨力和電泳結(jié)果重現(xiàn)性等方面建立DNA測(cè)序儀應(yīng)用性相關(guān)指標(biāo)并進(jìn)行論述,以期為DNA測(cè)序儀的應(yīng)用性能評(píng)價(jià)提供參考。

1 DNA測(cè)序儀應(yīng)用性能指標(biāo)

1.1 空間校正 spatial calibration

1.1.1 空間校正

空間校正即毛細(xì)管陣列在檢測(cè)窗口受激光激發(fā)產(chǎn)生的熒光信號(hào)落在CCD上的位置,建立每個(gè)毛細(xì)管發(fā)出的信號(hào)和信號(hào)落點(diǎn)位置之間的關(guān)系。其作用就是確定16根毛細(xì)管在CCD檢測(cè)器上的縱向最佳讀取位置并且可直接反映出激發(fā)光路狀態(tài)和CCD采集性能。

1.1.2 如何評(píng)價(jià)空間校正是否成功

評(píng)估定位結(jié)果,每根毛細(xì)管均有信號(hào)且呈單一尖峰;相鄰兩個(gè)峰像素差值在13-16之間(如圖1)。若不滿足則空間校正失敗(如圖2)。

圖1 成功的空間校正結(jié)果

圖2 失敗的空間校正結(jié)果

1.2 光譜校正spectral calibration

1.2.1 光譜校正

DNA測(cè)序儀對(duì)STR進(jìn)行分型采用的是多色熒光檢測(cè)系統(tǒng),其本質(zhì)是不同的熒光素在其中心發(fā)射波長(zhǎng)出的信號(hào)。在DNA測(cè)序儀中,使用面陣CCD進(jìn)行光譜采集,面陣CCD高250像素,寬512像素,圖3中央顯示了毛細(xì)管的光譜到CCD上的映射關(guān)系,圖中,毛細(xì)管編號(hào)為①②......,每個(gè)毛細(xì)管的光譜展開到CCD上都是一個(gè)長(zhǎng)條型的空間,選一個(gè)長(zhǎng)條形空間放大,如圖4所示,每個(gè)bin大小為3×14,一根毛細(xì)管的光譜展開占用20個(gè)bin,這樣一個(gè)長(zhǎng)條型的空間的大小將為3×(14×20)=3×280,單位均為像素。

圖3 光譜采集用的面陣CCD

圖4 一根毛細(xì)管對(duì)應(yīng)的一組bin

圖5 熒光標(biāo)準(zhǔn)物的光譜分布

圖6 成功的光譜校正

圖7 失敗的光譜校正

圖8 電泳過程監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)

圖9 186bp和187bp電泳分離結(jié)果

光譜校正主要是解決一個(gè)光譜空間到染料空間的一個(gè)映射問題。STR分型中,一般會(huì)采用四種或五種熒光染料(即染料空間)去標(biāo)記片段長(zhǎng)度不同的基因座,在特定時(shí)間檢測(cè)到某種熒光就意味著檢測(cè)到某個(gè)特定基因座,但是實(shí)際情況是熒光染料的光譜空間一般都比較大,以在STR分型中常用的5-FAM,JOE,NED,ROX四種熒光染料為例,它們的光譜范圍都比較寬,以JOE為例,它的光譜范圍就跨越了520—640nm的光譜空間,這樣當(dāng)用JOE標(biāo)記的某種基因座出現(xiàn)時(shí),整個(gè)光譜空間都能檢測(cè)到熒光,依次為藍(lán)色、綠色、黃色、紅色(光譜空間),如果直接采集染料發(fā)生的光譜,任何一種染料標(biāo)記的堿基過來我們都能在藍(lán)色、綠色、黃色、紅色(光譜空間)上檢測(cè)到強(qiáng)弱不一的信號(hào),這樣會(huì)導(dǎo)致基因座識(shí)別無法進(jìn)行。實(shí)際上,這就是染料空間到光譜空間的映射問題,因?yàn)槿玖峡臻g到光譜空間不是一一映射關(guān)系,所以不能直接用光譜空間來分辨四種染料,如果4種熒光染料發(fā)的熒光都具有激光一樣的單色性,如5-FAM只發(fā)540nm的藍(lán)光,那么染料空間到光譜空間將是一一映射的關(guān)系,那樣的情況下光譜將不需要進(jìn)行光譜校正(如圖5)。

因此,光譜校正能否成功,是評(píng)價(jià)激發(fā)系統(tǒng)、分光系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)性能的重要指標(biāo)。

1.2.2 如何評(píng)價(jià)光譜校正是否成功

以ABI DS-33光譜校正試劑為例,每根毛細(xì)管質(zhì)量數(shù)Q值大于0.95,條件數(shù)C值在8.5-14.5之間,綠色圓點(diǎn)表示光譜校正通過(如圖6)。若未達(dá)到Q值及C值的顯示為紅色圓點(diǎn)則表示光譜校正失敗(如圖7)。

表1 電泳過程監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)參數(shù)范圍

圖10 500bp和501bpDNA片段的分離結(jié)果

1.3 電泳過程監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)electrophoresis trace data

電泳過程監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)是監(jiān)測(cè)電泳整個(gè)過程中的環(huán)境溫度、CCD溫度、CellHeater溫度、EPT電流、EPT電壓、激光器電流、激光器功率和恒溫箱溫度等各系統(tǒng)運(yùn)行參數(shù)數(shù)據(jù),其中除環(huán)境溫度以外的參數(shù)均為DNA測(cè)序儀器性能的重要指標(biāo)(如圖8)。

電泳過程中的每個(gè)參數(shù)的固定范圍值(如表1)。

(1)CCD溫度。CCD溫度顯示當(dāng)前電泳過程中CCD的溫度值,其范圍為-10℃～-9.8℃,CCD溫度曲線應(yīng)呈直線狀。

(2)CellHeater溫度。CellHeater溫度表示恒溫箱加熱板的溫度,其變化范圍為68℃~80℃,在恒溫箱溫度上升時(shí),CellHeater溫度呈曲線變化,待恒溫箱溫度穩(wěn)定后,CellHeater溫度保持恒定,CellHeater曲線呈平滑直線狀。

(3)恒溫箱溫度。恒溫箱溫度表示恒溫箱內(nèi)的溫度值,在恒溫箱溫度上升時(shí),曲線呈平滑上升狀,溫度穩(wěn)定后曲線呈平滑直線狀。恒溫箱溫度保持平穩(wěn)后,其溫度值要與軟件設(shè)定的溫度一致,通常STR電泳的恒溫箱溫度保持在60℃。

(4)EPT電壓。EPT電壓表示當(dāng)前電泳電壓值,EPT電壓值要與軟件設(shè)定的電壓值一致,通常STR電泳的EPT電壓值設(shè)定為15kv。

(5)EPT電流。EPT電流表示電泳過程中電泳通路內(nèi)的電流值,EPT電流會(huì)受到ETP電壓、緩沖液離子濃度和凝膠電導(dǎo)率等因素影響。當(dāng)EPT電壓為15kv時(shí),EPT電流值范圍為130uA～180uA。

(6)激光器電流。激光器電流表示電泳過程中激光器當(dāng)前的電流值,在電泳過程中,激光器電流保持恒定,其變化范圍為4.0A～6.5A。

(7)激光器功率。激光器功率表示電泳過程中激光器的功率,激光器功率的大小由激光器電流和電壓大小決定,DNA測(cè)序儀中激光器功率一般保持在14.5mW～15.1mW。如果激光器功率過高,會(huì)增大激光器的損耗,進(jìn)而降低DNA測(cè)序儀的使用壽命,激光器功率過低會(huì)降低熒光激發(fā)效率,影響電泳數(shù)據(jù)采集及STR分型的結(jié)果。

1.4 單堿基分辨力single base resolution

單堿基分辨能力指DNA測(cè)序儀能否成功分離帶有相同熒光素標(biāo)記的長(zhǎng)度相差1bp的兩個(gè)DNA片段。

在法醫(yī)DNA鑒定中,STR基因座擴(kuò)增片段一般在500bp以下,相同STR基因座擴(kuò)增片段長(zhǎng)度最小可以相差1bp(如圖9),因此DNA測(cè)序儀能否成功分離相差1bp的相鄰DNA片段成為檢測(cè)儀器性能的重要指標(biāo),同時(shí)可對(duì)電泳過程中電壓的穩(wěn)定性、激光激發(fā)效率、CCD數(shù)據(jù)采集精度等方面進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

市場(chǎng)上用于檢測(cè)分辨力的標(biāo)準(zhǔn)品通常是ABI公司的Allelic Ladder。Allelic Ladder中含有186bp和187bp兩個(gè)相差1bp的DNA片段,在法醫(yī)鑒定檢測(cè)中,大多根據(jù)這兩個(gè)片段的分離情況來初步檢驗(yàn)儀器是否滿足STR分型所需的分辨力要求,如圖9。本項(xiàng)目組曾成功設(shè)計(jì)了帶有6-FAM熒光標(biāo)記的500bp和501bp的DNA片段,并在自主研制的DNA測(cè)序儀上成功進(jìn)行了電泳分離,驗(yàn)證了該儀器滿足了測(cè)序儀單堿基分辨力的指標(biāo),如圖10[3][4]。

1.5 電泳結(jié)果均一性electrophoresis homogeneity

STR電泳時(shí),樣品中都要加入size standard作為分子量?jī)?nèi)標(biāo),分型軟件在定義分子量?jī)?nèi)標(biāo)的時(shí)候,250bp有意未作定義,這樣就可以通過計(jì)算確定該片段的實(shí)際大小,一般情況下都是246左右,它可以作為一個(gè)標(biāo)志,只有該值相差不到1bp時(shí),才認(rèn)為16根毛細(xì)管中樣品的電泳遷移速率是一致的,因此其可用于判定電泳過程中16根毛細(xì)管電壓電流的一致性,恒溫箱溫度的均衡性。

2 結(jié)語(yǔ)

DNA測(cè)序儀是當(dāng)前法醫(yī)DNA檢驗(yàn)技術(shù)中重要的檢驗(yàn)儀器,具有高分辨率、高通量、易用性及對(duì)于樣品的小量需求等優(yōu)點(diǎn),但目前尚文獻(xiàn)提出無針對(duì)DNA測(cè)序儀應(yīng)用性能的系統(tǒng)評(píng)價(jià)指標(biāo)和評(píng)價(jià)方法,本項(xiàng)目組經(jīng)過長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)積累和文獻(xiàn)查詢總結(jié)了以上評(píng)價(jià)儀器應(yīng)用性能的指標(biāo),并提出了相應(yīng)的檢測(cè)方法,以期為DNA測(cè)序儀的研發(fā)及生產(chǎn)提供參考。

[1]鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M].中國(guó)人民公安大學(xué)出版社,2002(11).

[2]布爾特爾(John M.Butler).法醫(yī)DNA分型專論:方法學(xué)(原書第3版)[Advanced Topics in Forensic DNA Typing:Methodology(3rd)][M].科學(xué)出版社,2013(3):31.

[3]趙穎.DNA分析儀性能評(píng)價(jià)方法研究[C].公安部第一研究所論文集,2010.

[4]榮海博.DNA測(cè)序儀分辨力測(cè)試方法研究[C].公安部第一研究所論文集,2010.