劉瑞雪 王魯敏 黃倩倩

（山東省即墨市畜牧獸醫(yī)局 266200）

一株豬II型鏈球菌分離鑒定及生物特性研究

劉瑞雪 王魯敏 黃倩倩

（山東省即墨市畜牧獸醫(yī)局 266200）

從即墨某豬場(chǎng)發(fā)病豬的關(guān)節(jié)液中分離出一株疑似鏈球菌，通過菌落形態(tài)、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)及PCR檢測(cè)對(duì)分離的疑似豬鏈球菌進(jìn)行初步研究。經(jīng)菌落形態(tài)學(xué)和生化鑒定為豬鏈球菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株對(duì)氧氟沙星、環(huán)丙沙星中度敏感，對(duì)先鋒霉素V、復(fù)合磺胺、強(qiáng)力霉素敏感。通過對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR鑒定及分型，確認(rèn)該菌株為豬II型鏈球菌。

豬；鏈球菌；藥敏試驗(yàn)；生化試驗(yàn)；PCR

當(dāng)前，豬鏈球菌病已成為嚴(yán)重影響各國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種重要的人獸共患傳染病。鏈球菌可引起豬的多種疾病，主要以敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、淋巴結(jié)炎為主要發(fā)病特征。該病分布廣泛，發(fā)病率高，特別是急性敗血癥和腦膜炎型鏈球菌病，其病死率較高，對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)造成較大危害，因此愈來愈引起人們的高度關(guān)注[1,2,3]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于豬鏈球菌血清型的檢測(cè)，使得該病的檢測(cè)越來越簡(jiǎn)便和靈敏。

1 材料

1.1 病料來源

病料來源于即墨市某養(yǎng)豬場(chǎng)病死豬，無菌采取發(fā)病豬心血、肝、淋巴結(jié)、腦和關(guān)節(jié)液保存，以備分離菌株。

1.2 培養(yǎng)基

將TSA胰蛋白胨大豆瓊脂、TSB胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，購自英國OXOID公司，按照產(chǎn)品說明書配制，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后加入新生牛血清和NAD溶液，使其濃度分別為5%和0.02%。

1.3 生化試劑

生化管為：6.5%高鹽肉湯、甘露醇、海藻糖、山梨醇、乳糖、菊糖、馬尿酸鈉、七葉苷和明膠，購自杭州天和微生物公司。

1.4 藥敏紙片

青霉素G、阿莫西林、鏈霉素、先鋒霉素V、氧氟沙星、卡那霉素、氯霉素、新霉素、慶大霉素、紅霉素、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)合磺胺13種藥敏紙片購自杭州天和微生物公司。

2 方法

2.1 菌株的分離

將采集的病料劃線接種于含有5%犢牛血清的TSA平皿上，37℃培養(yǎng)12～24h后觀察，挑取直徑0.1～1.0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊的小菌落進(jìn)行革蘭氏染色。革蘭氏染色陽性、成對(duì)或有鏈狀排列的球形細(xì)菌為可疑菌落，對(duì)其傳代純化。

2.2 生化試驗(yàn)

對(duì)于純化好的可疑菌落按使用說明做以下生化實(shí)驗(yàn)： 6.5%高鹽肉湯、甘露醇、海藻糖、山梨醇、乳糖、菊糖、馬尿酸鈉、七葉苷和明膠。符合鏈球菌生化標(biāo)準(zhǔn)的菌株判為鏈球菌。

2.3 藥敏試驗(yàn)

按標(biāo)準(zhǔn)紙片瓊脂擴(kuò)散法 （K-B法）操作。

2.4 PCR鑒定

2.4.1 本試驗(yàn)所用PCR引物見附表。

2.4.2 PCR模板、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

按試劑盒說明書提取鏈球菌基因組為PCR模板。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按參考文獻(xiàn)進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 菌落形態(tài)

通過菌體形態(tài)、革蘭氏染色，初步判定從即墨某豬場(chǎng)的發(fā)病豬的關(guān)節(jié)液中分離出一株疑似豬源鏈球菌，命名為SS1（見附圖）。

附圖 疑似豬鏈球菌的形態(tài)圖

附表 本試驗(yàn)所用PCR引物

3.2 生化鑒定

該疑似鏈球菌SS1株不發(fā)酵甘露醇、山梨醇、海藻糖、七葉苷、菊糖、乳糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，無運(yùn)動(dòng)性，符合豬鏈球菌的生化特性。

3.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

該疑似鏈球菌SS1株對(duì)青霉素G、阿莫西林、鏈霉素、卡那霉素、氯霉素、新霉素、慶大霉素、紅霉素耐藥；對(duì)氧氟沙星、環(huán)丙沙星中度敏感，對(duì)先鋒霉素V、復(fù)合磺胺、強(qiáng)力霉素敏感。

3.4 PCR鑒定

用豬鏈球菌通用引物進(jìn)一步做PCR鑒定，確認(rèn)SS1株為豬鏈球菌；又將其進(jìn)行豬II型鏈球菌通用引物的鑒定，結(jié)果表明該菌株的序列與NCBI上發(fā)布的豬II型鏈球菌基因序列的同源性均為98%。

4 討論

由于鏈球菌廣泛存在于正常豬的呼吸道、扁桃體等器官和組織中[1.3]。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，所分離的先鋒霉素V、復(fù)合磺胺、強(qiáng)力霉素，而對(duì)大多數(shù)藥物如青霉素G、阿莫西林、鏈霉素、卡那霉素、氯霉素、新霉素、慶大霉素、紅霉素均產(chǎn)生較高的抗藥性。因此，臨床上可把先鋒霉素V和環(huán)丙沙星作為治療豬鏈球菌病的首選藥物。

在歐洲導(dǎo)致豬發(fā)生豬鏈球菌病以R群的II型豬鏈球菌為主，其次是1型、9型、7型和其它型[3,4]。而我國，以前以C群的馬鏈球菌獸疫亞種為主，近年來也常有豬鏈球菌II型的報(bào)道，該研究中豬II型鏈球菌在山東省即墨某豬場(chǎng)發(fā)現(xiàn)，表明該型鏈球菌已在山東流行，但是該菌株并未對(duì)該豬場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，表明該分離菌株毒力較弱。

本研究對(duì)該菌株進(jìn)行了初步研究，有利于該豬場(chǎng)豬鏈球菌病的防控，間接促進(jìn)該豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。

[1]黃毓茂,黃引賢,等.II型豬鏈球菌的血清學(xué)鑒定[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),1995,15(1):63-65.

[2] 姚火春,陳國強(qiáng),陸承平,等.豬鏈球菌1998分離株病原特性鑒定[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).1999,22（2）:67-70.

[3]Yu H,Jing H,Chen Z,et al.Huma Streptococcus suis outbreak,Siehuan China[J].Emerg Infect Dis,2006,12（6）:914-920.

[4]Smith H E,de Vries R,van Slot R.The cpslocus of Streptococcus suis serotype 2:genetic determinant for the synthesis of sialic acid[J].Microb Pathog,2000,29:127-134.