段巍鶴，鄭宏亮，陸美林，萬家余，何秀霞

（1.長春理工大學(xué) 校醫(yī)院，長春 130022，2.長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022，3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所，長春 130122）

細胞內(nèi)信號傳遞通過中心轉(zhuǎn)換站接收、調(diào)節(jié)和傳遞信號。小分子量G蛋白家族構(gòu)成了對生長、分化、形態(tài)發(fā)生、囊泡轉(zhuǎn)運和細胞骨架形成極其重要的膜相關(guān)轉(zhuǎn)運站。Ras蛋白是一個分子質(zhì)量為21kD左右的單體GTP酶，參與典型的G蛋白激活和失活循環(huán)。Ras突變常見于人類許多癌癥中。突變后持續(xù)活化的生長信號導(dǎo)致細胞的惡性增殖。并且，Ras蛋白大量存在于神經(jīng)中樞中。因此，Ras蛋白在細胞的生長分化、細胞的癌變、信號的的傳遞等方面扮演著重要的作用，其在癌癥的預(yù)防、診斷、治療方面的研究越來越深入，而在學(xué)習(xí)記憶功能方面的研究同樣受到了國內(nèi)外的關(guān)注［1，2］。為此，對Ras基因和蛋白的細致研究可以產(chǎn)生巨大經(jīng)濟價值和醫(yī)療價值，將會對人類腫瘤的治療和學(xué)習(xí)記憶功能的發(fā)展帶來突破性的進展［3-7］。

本實驗利用敲除Ras-GRF1基因的雌性小鼠（Ras-GRF10/0）進行自主活動實驗以檢測機體運動狀態(tài)；通過莫里斯水迷宮實驗評估轉(zhuǎn)基因和敲除小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力［8-12］；通過避暗穿梭實驗、跳臺實驗等判斷小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能是否受到影響［13］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗小鼠

Ras-GRF10/0基因敲除小鼠由美國公司構(gòu)建，野生型老鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供。各品系老鼠均有十四只。

1.1.2 實驗儀器

伯樂高電壓電泳儀Biorad Powerpac HV 164-5056，伯樂小型電泳槽，伯樂C1000 PCR儀均為伯樂公司生產(chǎn)；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)，避暗穿梭測試儀XR-YLS-17B，自主活動箱，跳臺實驗設(shè)備均為北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Ras-GRF10/0純合敲除鼠的擴繁

將成年（大于6周齡）首建的雜合敲除鼠按每籠3只雌鼠1只雄鼠合籠，養(yǎng)殖房需要溫度可控（22℃），采取等晝夜長，水和食物可以供小鼠自由食用的方式來飼養(yǎng)。待母鼠產(chǎn)的子代小鼠長到5周大的時候，打耳號區(qū)分每一只鼠。

1.2.2 Ras-GRF10/0基因敲除小鼠的鑒定

利用Axygen公司提供的AxyPrep基因組DNA小量試劑盒提取小鼠的基因組。將提取DNA進行PCR以鑒定所用Ras-GRF10/0老鼠是否為純合老鼠。

1.2.3 自主活動箱

自主活動箱由長方體不透光的封閉空間組成。內(nèi)壁含有4個光電管，可以測定小鼠的自主活動次數(shù)。將小鼠輕輕放進自主活動箱，然后將蓋子蓋上。以5min為測試時間，連續(xù)五天。第一次實驗時需給予小鼠3min適應(yīng)實驗。

1.2.4 Morris水迷宮

連續(xù)進行7天定位航行試驗；第八天撤去隱藏平臺，即空間搜索實驗。將小鼠輕輕地放置在隱藏的平臺，小鼠在隨后會逃離平臺，允許小鼠在池內(nèi)游泳，以適應(yīng)環(huán)境，然后用手，引導(dǎo)小鼠慢慢游向隱藏平臺，并保證小鼠在平臺上至少停留15s。在水迷宮分析系統(tǒng)中人為地將水池分為4個象限，分后隨機在4個象限中選取入水點。入水時，小鼠面向水池壁，防止其觀察到隱藏平臺，然后讓小鼠在四個象限中自由游泳，時間規(guī)定為120s。若在120s內(nèi)小鼠找到隱藏平臺并在平臺停留至少5s，則結(jié)束實驗，時間即為該小鼠的逃避潛伏期；若沒有找到，則需要人為地誘導(dǎo)小鼠尋找隱藏平臺，然后讓其停留至少15s，逃避潛伏期記作120s。同時記錄每次小鼠的游泳軌跡。第八天進行空間搜索實驗，在沒有隱藏平臺的情況下，記錄小鼠第一次穿越平臺的時間，游泳軌跡以及在120s內(nèi)穿越平臺的次數(shù)。

1.2.5 避暗穿梭

實驗設(shè)備是由長寬各為20cm，高為15cm的四個不透光的封閉空間組成，分為A、B、C、D四個區(qū)域，A和C作為一組測量儀器，B與D作為一組。其底部均由可通電的電柵組成。每個空間內(nèi)有均有自動傳感器可以測量小數(shù)的活動。實驗時，將小鼠輕輕的放進A、B兩室中，然后將蓋子蓋上，通電后，A、B兩室將閃爍燈光，C、D兩室會以限壓30V，限流0.5mA的電流持續(xù)通電。以5min為測試時間，連續(xù)三天。同樣第一次實驗時需給小鼠3min的適應(yīng)時間。

1.2.6 跳臺實驗

將小鼠放置到實驗設(shè)備的圓柱體平臺中，將蓋子蓋上。將會有限壓30V，限流0.5mA的電流通過底部的電柵。以5分鐘為測試時間，連續(xù)兩天。在第一天的實驗中，給予小鼠三分鐘的適應(yīng)時間。

每批小鼠在完成上述實驗后，都要及時的用清水清理實驗儀器，防止有氣味等因素干擾小鼠的判斷。實驗前后保持安靜，溫度為21℃恒定。

2 實驗結(jié)果

2.1 Ras-GRF10/0純合老鼠的鑒定

為了得到足夠數(shù)量的純合Ras-GRF10/0小鼠，進行種內(nèi)自交，在F1代群體中，通過PCR技術(shù)鑒定雜合型和純合型后代。通過圖1PCR的鑒定結(jié)果可以看出，雜合型小鼠電泳結(jié)果中有兩條電泳條帶如5、7、8、9、10、11、12泳道，有清晰單一條帶的為Ras-GRF10/0純合小鼠如3、4泳道，2、6泳道則為野生型小鼠。以PCR檢測為純合的小鼠進行后續(xù)實驗。

圖1 Ras-GRF10/0PCR鑒定結(jié)果

圖1中，1為DL2000 Marker；2和6：野生型小鼠PCR結(jié)果；3和4：Ras-GRF10/0純合小鼠的PCR結(jié)果；5，7，8，9，10，11，12：為Ras-GRF10/0雜合小鼠的鑒定結(jié)果.

2.2 自主活動實驗結(jié)果

在自主活動的實驗中，野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠在活動性上隨著時間的推移均有所下降，但下降的幅度不大，且Ras-GRF10/0小鼠活動次數(shù)整體少于野生型小鼠。但是沒有顯著性差異。實驗數(shù)據(jù)見表1。

表1 野生型小鼠和Ras-GRF10/0型小鼠自主活動次數(shù)（單位：次）

表2 野生型小鼠與Ras-GRF10/0型小鼠逃避潛伏期（單位：秒）

2.3 水迷宮實驗結(jié)果

2.3.1 定位航行試驗結(jié)果

由Morris水迷宮得出兩種小鼠的平均逃避潛伏期見表2，野生型小鼠逃避潛伏期有逐漸降低的趨勢，實驗的5～7天逃避潛伏期有平穩(wěn)的趨勢。而Ras-GRF10/0小鼠的逃避潛伏期在實驗的前兩天幾乎沒有變化，從實驗的第三天開始，有逐漸降低的趨勢。對比野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠，可以明確發(fā)現(xiàn)兩者在逃避潛伏期的第1天沒有顯著差異，第2天則表現(xiàn)差異顯著（P＜0.05），第3～7天則差異極顯著（P＜0.01）。從游泳軌跡（見圖2）也證實了這一點，即隨著時間的延長，野生鼠目的性更強，游泳軌跡更直接。

2.3.2 空間探索實驗

實驗的第八天，撤去水下的隱藏平臺。通過對比野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠在120s內(nèi)穿越平臺的平均次數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)野生型平均穿越次數(shù)為6.1要大于Ras-GRF1基因敲除小鼠的5次穿越次數(shù)。雖然在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著差異，但從兩者空間探索軌跡可以看出野生鼠的探索次數(shù)多于Ras-GRF10/0小鼠，搜索性更強（圖3）。

2.4 避暗穿梭實驗結(jié)果

從表3避暗實驗結(jié)果顯示，5min內(nèi)兩種小鼠被電擊次數(shù)在第一天有顯著差異，之后則沒有表現(xiàn)出差異，但Ras-GRF10/0型小鼠被電擊次數(shù)多于野生型小鼠。對比野生型小鼠和Ras-GRF10/0型小鼠主動回避潛伏時間可以看出（如表4）在實驗的第一天潛伏期都很短，但Ras-GRF10/0型小鼠第一天和第二天的潛伏期均遠遠低于野生型小鼠，在實驗的第三天，即最后一天中，這兩種小鼠的差異變得很小。

2.5 跳臺實驗結(jié)果

圖2 野生型小鼠與Ras-GRF10/0型小鼠游泳軌跡

圖3 野生型小鼠和Ras-GRF1小鼠空間探索軌跡

通過分析對比跳臺實驗結(jié)果（圖4）可以看出兩者在跳下平臺的時間沒有顯著差異，但Ras-GRF10/0型小鼠的潛伏期小于野生型小鼠。在第一天的實驗中，Ras-GRF10/0型小鼠跳臺次數(shù)大于野生型小鼠差異顯著。在第二天的實驗中兩種小鼠的跳臺次數(shù)略有差距（見圖5）。

表3 野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠5min被電擊次數(shù)（單位：次）

表4 野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠主動回避潛伏時間（單位：秒）

圖4 野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠第一次跳下平臺的時間

圖5 野生型小鼠和Ras-GRF10/0小鼠5min內(nèi)跳臺次數(shù)

3 討論

自主活動實驗結(jié)果說明，在自主活動能力上、在體力上，野生型小鼠與Ras-GRF10/0型小鼠沒有較大的區(qū)別。跳臺試驗說明Ras-GRF10/0型小鼠的平均潛伏期與野生型大致相同，但跳臺次數(shù)Ras-GRF10/0型小鼠多于野生型。Morris水迷宮的空間探索實驗結(jié)果說明Ras-GRF10/0型小鼠對平臺所在位置并沒有顯著的記憶。避暗穿梭實驗進一步說明Ras-GRF10/0型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力不如野生型小鼠。

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