陳嬋嬋 綜述 凌均棨 審校

(中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州510055)

Wnt是一類分泌型糖蛋白，在哺乳動(dòng)物中至少有19種，是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，可通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用。根據(jù)其轉(zhuǎn)導(dǎo)方式可將Wnt信號(hào)通路分為經(jīng)典Wnt/β -catenin信號(hào)通路以及非經(jīng)典通路Wnt/Ca2+、Wnt/PCP、Wnt/RAPI等。Wnt蛋白亦分為兩類:①Wnt1家族，包括Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a 等，能有效激活經(jīng)典信號(hào)通路;②Wnt5a家族，包括Wnt4、Wnt5a、Wnt11等，不但不能有效激活經(jīng)典信號(hào)通路，甚至對(duì)其還有抑制作用［1］。

經(jīng)典Wnt信號(hào)通路抑制劑有sFRP家族和DKK家族，可通過結(jié)合Wnt信號(hào)分子和競爭性結(jié)合輔助受體LRP5/6抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，從而發(fā)揮其抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的作用。Wnt信號(hào)分子在個(gè)體發(fā)育中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［2］。大量來自基因敲除的研究結(jié)果顯示，包括顱面部器官在內(nèi)的幾乎所有器官發(fā)生過程都必需有Wnt信號(hào)通路的調(diào)控。本文就Wnt信號(hào)通路在牙齒發(fā)育和牙囊成骨/成牙骨質(zhì)向分化中的作用研究進(jìn)展作一綜述。

1 Wnt信號(hào)分子在牙齒發(fā)育過程中的表達(dá)分布

在牙形態(tài)發(fā)生過程中，Wnt經(jīng)典信號(hào)通路參與了上皮和間充質(zhì)的相互作用。Sarkar等［3］研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育中的大鼠牙齒有 Wn t-3a、4a、5a、6b、7b、10b等分子的表達(dá);同時(shí)還表達(dá)Wnt的受體MFz6和拮抗劑/激動(dòng)劑MFrzbl和MFrp2。原位雜交檢測顯示，在人牙齒的發(fā)育過程中有Wnt信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子 Wnt配體(Wnt3，Wnt5a)、受體(FZD4，F(xiàn)ZD6，LRP5)、傳導(dǎo)因子(β-catenin)、轉(zhuǎn)錄因子(TCF4，LEF1)以及信號(hào)通路抑制劑(DKK1，Sostdc1)mRNA的表達(dá)，并具有特異性時(shí)空分布的特點(diǎn)［4］。有研究顯示，Wnt3、Wnt3a和 β-catenin 在大鼠牙齒牙囊的表達(dá)基本一致，在出生5 d的大鼠牙齒牙囊中開始呈弱表達(dá)，此后逐漸增強(qiáng)并持續(xù)到第13天;Wnt3a在體外培養(yǎng)的牙囊細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，而且成骨誘導(dǎo)可促進(jìn)其表達(dá)，推測Wnt3a參與牙萌出及成骨發(fā)生過程［5-6］。而Wnt5a在大鼠牙囊組織中的表達(dá)從出生后第3天開始，信號(hào)持續(xù)至第11天，但其表達(dá)強(qiáng)度弱于周圍礦化的牙槽骨細(xì)胞和成釉細(xì)胞［7］。Cai等［8］研究顯示，在小鼠胚胎發(fā)育的第14～17天時(shí)，其牙源性上皮和間充質(zhì)中均強(qiáng)表達(dá)wnt5a。目前已證實(shí)，Axin2在細(xì)胞質(zhì)中可通過降解β-catenin而達(dá)到抑制Wnt信號(hào)的作用，是經(jīng)典wnt信號(hào)通路的重要組成因子。Lohi等［9］發(fā)現(xiàn)，隨著牙齒發(fā)育，Axin2先在初級(jí)釉結(jié)節(jié)、次級(jí)釉結(jié)節(jié)以及它們下方的間充質(zhì)中表達(dá);小鼠出生后，Axin2主要在發(fā)育中的牙本質(zhì)、牙乳頭和牙根區(qū)域表達(dá)，說明Axin2對(duì)晚期牙齒發(fā)育中的釉質(zhì)成型和牙根發(fā)育具有重要作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠牙發(fā)育過程中的牙骨質(zhì)生成起始階段表達(dá)Wnt信號(hào)通路抑制劑Sclerostin［10］;并發(fā)現(xiàn)，Sclerostin 能抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成，提示其可維持牙骨質(zhì)細(xì)胞的穩(wěn)定性［11］。

2 Wnt信號(hào)通路對(duì)牙齒發(fā)育的調(diào)控機(jī)制

Chen等報(bào)道，敲除小鼠的牙源性間充質(zhì)中的β-catenin后，會(huì)導(dǎo)致其臼齒發(fā)育停止在帽狀期之前［12］。在轉(zhuǎn)基因小鼠的胚胎口腔上皮組織連續(xù)表達(dá)穩(wěn)定形式的β-catenin，會(huì)使其口腔中形成超數(shù)牙［13-14］。β-catenin在牙源性間充質(zhì)中過表達(dá)可使轉(zhuǎn)基因小鼠的牙齒形成過量牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)，說明Wnt/canonical信號(hào)通路對(duì)牙發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用［15］。Zhang 等［16］發(fā)現(xiàn)，在成牙本質(zhì)細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞中條件性敲除β-catenin后，可導(dǎo)致小鼠出生后牙根發(fā)育停滯。Wnt5a基因敲除的小鼠在胚胎第16.5天時(shí)出現(xiàn)牙胚發(fā)育遲緩，從而導(dǎo)致其出生后形成較小且形態(tài)異常的牙齒，并伴隨牙本質(zhì)分化遲緩［17］。Porcn蛋白是一種膜結(jié)合O?；D(zhuǎn)移酶，對(duì)Wnt蛋白的棕櫚?；?almitoylation)、分泌和蛋白活性起決定性作用［18］。Dias等［19］在對(duì)病灶性真皮發(fā)育不全(Focal dermal hypoplasia，F(xiàn)DH)的患者進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，X染色體上PORCN基因突變可刺激wnt家族蛋白的分泌，從而導(dǎo)致包括皮膚、骨骼、眼和牙齒等多器官的發(fā)育異常;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在新生患兒的上頜就已有2個(gè)乳牙萌出。Maalouf等［20］也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DH患者存在單側(cè)恒牙發(fā)育異常。另有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠牙蕾狀期用經(jīng)典Wnt信號(hào)通路抑制劑DKK1對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，可使牙齒產(chǎn)生不鋒利的牙尖形態(tài)［13］。

大量研究表明，哺乳動(dòng)物的牙齒發(fā)育受到Wnt經(jīng)典信號(hào)通路和來自其他生長信號(hào)通路分子的共同調(diào)節(jié)［21-22］。Cho 等［23］認(rèn)為，Shh、Sostdc1 與 Wnt之間通過形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)體系，共同調(diào)節(jié)牙齒形態(tài)的空間發(fā)生。Cai等［8］研究顯示，在小鼠胚胎發(fā)育的第14～17天，Wnt5a的表達(dá)分布與Shh和Bmp4的表達(dá)部分重疊，外源性Wnt5a在體內(nèi)和體外均會(huì)引起牙形態(tài)較小和牙尖圓鈍，而凋亡抑制劑的使用則可減緩這一效應(yīng);推測其機(jī)制可能是:牙齒發(fā)育過程中，Wnt5a在非牙源性上皮和間充質(zhì)中通過引起細(xì)胞凋亡限制牙胚過度增長，而在牙胚內(nèi)部，Shh和Bmp4則可使細(xì)胞免于凋亡。Yang等［24］發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠牙源性間充質(zhì)中的 Tgfbr2可導(dǎo)致wnt5a表達(dá)上調(diào)和 Fgf3/10的表達(dá)下調(diào)，并通過兩者協(xié)同加強(qiáng)上皮中的Lrp5/6-β-catenin信號(hào);提示TGF-β信號(hào)通路通過Wnt信號(hào)途徑調(diào)節(jié)上皮與間充質(zhì)的相互作用，從而維持牙源性上皮干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。以上研究結(jié)果均表明，Wnt信號(hào)通路在牙齒的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。

3 Wnt信號(hào)通路參與牙囊細(xì)胞的成骨/成牙骨質(zhì)向分化

近期研究結(jié)果顯示，Wnt信號(hào)通路可能參與了牙囊細(xì)胞的成骨/成牙骨質(zhì)向分化。Morsczeck等［25］的蛋白組學(xué)結(jié)果顯示，在人DFSCs的成骨/成牙骨質(zhì)向分化過程中有 Wnt通路分子的參與。Silvério 等［26］發(fā)現(xiàn)，在小鼠 DFCs中，BMP2 需要和Wnt/β-catenin信號(hào)通路相互作用促進(jìn)細(xì)胞成熟，但Wnt3a/β-catenin通路可抑制BMP2介導(dǎo)的成骨/成牙骨質(zhì)向分化。研究發(fā)現(xiàn)，Hertwig＇s上皮根鞘需通過Wnt信號(hào)通路調(diào)控牙囊細(xì)胞的成骨/成牙骨質(zhì)向分化;在此過程中，Wnt3a可顯著增加Hertwig＇s上皮根鞘對(duì)牙囊細(xì)胞成骨/成牙骨質(zhì)分化的促進(jìn)作用，而wnt信號(hào)通路抑制劑DKK1則能減弱這一效應(yīng)［27］。Nemoto 等［28］發(fā)現(xiàn)，分別采用 Wnt經(jīng)典信號(hào)通路激活劑LiCl和外源性激活蛋白Wnt3a處理體外培養(yǎng)的成牙本質(zhì)細(xì)胞，可下調(diào)細(xì)胞中ALP、BSP和OCN等成骨相關(guān)基因的表達(dá)，而抑制劑DKK1能減弱由Wnt3a引起的Runx2和OCN表達(dá)下調(diào)，但Wnt3a可上調(diào)cyclin D1的表達(dá);提示W(wǎng)nt能體外抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞的成骨分化，并促進(jìn)其增殖。本課題組前期研究顯示，在成骨誘導(dǎo)液的處理下，Wnt5a和Wnt3a蛋白均能顯著促進(jìn)大鼠牙囊細(xì)胞的骨向分化，其中以Wnt3a的作用較強(qiáng)［7］。

有實(shí)驗(yàn)表明，Wnt經(jīng)典和非經(jīng)典信號(hào)通路均參與了大鼠牙囊細(xì)胞的成骨/成牙本質(zhì)向分化過程:Wnt經(jīng)典信號(hào)通路核心蛋白β-catenin穩(wěn)定過表達(dá)可促進(jìn)大鼠牙囊細(xì)胞中β-catenin、RUNX2、OCN和I型膠原蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，從而增強(qiáng)其礦化能力;β-catenin穩(wěn)定沉默則能降低牙囊細(xì)胞中β-catenin、RUNX2、OCN 和 I型膠原的表達(dá)，并抑制其礦化能力;Wnt PCR芯片檢測結(jié)果顯示，100 g/L DMEM培養(yǎng)4周組的Fzd1基因上調(diào)、Wif1基因下調(diào)，礦化4周組Nkd2基因下調(diào)，礦化4周組與100 g/L DMEM培養(yǎng)4周組相比，Ccnd2基因明顯下調(diào);以上結(jié)果提示，牙囊細(xì)胞的增殖和分化需要Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的調(diào)控［5］。Nkd1和Nkd2是果蠅裸露角質(zhì)蛋白的哺乳動(dòng)物同源體，既是Wnt信號(hào)通路的下游靶基因，又可通過蓬亂蛋白(Dsh/Dvl)負(fù)向調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路，是一類胞內(nèi)可誘導(dǎo)性Wnt抑制劑，對(duì)維持Wnt信號(hào)通路的平衡狀態(tài)具有重要意義［29］。Nkd1和Nkd2基因雙敲除的小鼠會(huì)出現(xiàn)顱骨發(fā)育異常、顱縫骨閉合缺失、鼻骨較短［30］，但其對(duì)牙齒發(fā)育的影響目前尚未見報(bào)道。Wnt經(jīng)典信號(hào)途徑中的Wnt3蛋白在大鼠DFCs成骨誘導(dǎo)中的表達(dá)呈先增加后逐漸較少的趨勢(shì)，到第3周時(shí)其表達(dá)水平與陰性對(duì)照組相同;提示W(wǎng)nt3可能參與了牙囊細(xì)胞的早期成骨向分化［6］。有研究還發(fā)現(xiàn)，Wnt非經(jīng)典途徑蛋白Wnt5a可通過JNK和Ca2+信號(hào)通路促進(jìn)大鼠牙囊細(xì)胞的成骨向分化，并且與 BMP2通路間存在相互作用［7］。

綜上所述，Wnt信號(hào)通路不僅在牙發(fā)育和形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，同時(shí)還參與牙囊細(xì)胞的成骨/成牙骨質(zhì)向分化過程;但其具體調(diào)控機(jī)制以及與其他多種信號(hào)通路間形成的復(fù)雜調(diào)控體系目前尚不清楚，仍需進(jìn)一步深入研究。

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