王榮花(綜述)，王慧萍(審校)

(上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院實驗中心，上海 200080)

應用組織特異微RNA構建更加安全的腺病毒

王榮花(綜述)，王慧萍※(審校)

(上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院實驗中心，上海 200080)

摘要：溶瘤腺病毒是目前最有潛力的腫瘤治療病毒載體之一，但其在應用過程中會產生比較嚴重的毒副作用，特別是肝臟毒性。為了更好地針對組織靶標，需要制備更加安全、有效的溶瘤腺病毒。近年來，科學家使用微RNA(miRNA)調控基因表達系統(tǒng)，將若干拷貝數(shù)的組織特異性miRNAs對應的靶序列加入到腺病毒復制早期必需基因E1基因表達盒的3′非翻譯區(qū)，在轉錄后水平調控病毒復制。這種方法能有效消除腺病毒的毒副作用，進一步提高腺病毒使用的安全性。

關鍵詞：腫瘤；腺病毒；微RNAs

1985年，Ballay等[1]首次使用腺病毒作為基因載體。自此，腺病毒應用于腫瘤基因治療的研究迅速開展起來。腺病毒的理化性質穩(wěn)定，且容易制備純化，病毒滴度高，插入的外源基因片段長，可感染處于不同周期的細胞，轉染效率高，且無致突變的危險，尤其適用于腫瘤的基因治療，這些優(yōu)點使其成為目前應用最為廣泛的病毒載體之一[2]。

早先開發(fā)的復制缺陷型腺病毒載體在體內無增殖能力，容易被機體清除，這使得治療基因在體內表達時間相對較短，治療效果較弱。而目前廣泛使用的條件復制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus，CRAd)載體能克服這些缺點，其能夠選擇性地在腫瘤細胞內復制增殖并散播至更多的腫瘤細胞，有更強的腫瘤清除能力和更低的毒性[3]。構建CRAd的方法主要是在不同階段調控腺病毒復制早期必需基因的表達?，F(xiàn)對應用組織特異性微RNA(microRNA,miRNA)靶序列構建的CRAd予以綜述。

1腺病毒復制的調控

1.1轉錄前水平的調控 在轉錄前使腺病毒復制早期基因E1a/E1b突變或缺失可使腺病毒只在特定細胞中復制，如onyx-015可使E1b-55k基因缺失，從而不能編碼與p53結合的p105蛋白，使得其只能在p53功能缺陷的腫瘤細胞中復制[4]；Δ24腺病毒可在E1a的CR2區(qū)造成24 bp大小的堿基缺失突變，導致不能正常編碼Rb結合蛋白，因此腺病毒只能在Rb功能缺失的腫瘤細胞中選擇性復制[5]。

1.2轉錄水平的調控 在轉錄水平通常是使用一些特異性啟動子對腺病毒復制早期必需基因進行調控，如CN706使用前列腺特異性抗原基因增強子元件啟動子調控5型腺病毒復制早期必需基因E1A，使腺病毒只在表達前列腺特異性抗原的前列腺腫瘤細胞中復制[6]。CNHK500采用人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcript，hTERT)啟動子調控E1A基因、采用缺氧反應元件(hypoxia response element，HRE)啟動子調控E1B基因共同構建雙靶向條件增殖型腺病毒，使病毒的復制能更好地控制在具有高hTERT活性及高HRE活性的腫瘤細胞中[7]。

1.3轉錄后水平的調控 轉錄后調控主要是將組織特異性miRNA靶序列插入到腺病毒復制早期必需基因的3′非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)，調控病毒復制早期必需基因的特異性表達，進而達到調控腺病毒特異性復制的目的。

2組織特異性miRNA

1993年，在研究線蟲突變表型時第1次發(fā)現(xiàn)miRNA line-4 和let-7通過調控靶基因的翻譯調控胚胎的發(fā)育。利用突變體研究技術，越來越多的miRNA在包括人類、果蠅及植物等多種生物中發(fā)現(xiàn)[8-9]。miRNA在細胞生長、增殖、分化、凋亡及細胞信號網(wǎng)絡、基因調控網(wǎng)絡中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用[10]。

miRNA是高度保守的小的非編碼RNA，大約22個核苷酸長度，調控著約30%的人類基因[11]。在轉錄和加工后，成熟的miRNA的一條鏈形成一個RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，然后成熟的miRNA引導RISC與目的信使RNA(messenger RNA,mRNA)的部分堿基完全互補配對結合，從而降解mRNA，沉默靶基因。這個機制在動、植物中廣泛存在。另一種更加普遍的機制是通過與mRNA 3′UTR不完全互補，在翻譯水平遏制基因的表達。這種機制下，miRNA只減少了靶基因在蛋白水平的表達，并未改變靶基因在mRNA水平的表達[12-13]。

隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，miRNA具有高穩(wěn)定性、時空特異性及細胞或組織特異性[14]。如成年人肝臟正常組織中高表達miR-122和miR-92a，而胎兒肝臟正常組織中則高表達miR-483；在一些腫瘤組織中低表達，而在正常組織細胞中高表達的有miR-143、miR-14、miR-199及l(fā)et-7a等[15-18]。

3應用肝組織特異性miRNA降低腺病毒的肝臟毒性

2006年，Brown等[19]將miR-142-3p的靶序列插入到慢病毒載體中，遏制病毒在造血細胞系的復制，在非造血細胞系維持正常復制。這個實驗展示了復制病毒載體設計的新形式。之后，人們把這種模式引入到腺病毒中，即在腺病毒復制早期必需基因E1A3′UTR或E1B3′UTR中加入幾個拷貝組織特異性的miRNA靶序列。加入肝臟特異性miRNA靶序列可降低肝臟毒性，加入正常組織細胞與腫瘤組織細胞差異表達的miRNA靶序列可保護正常組織細胞，而使腺病毒在腫瘤細胞中的復制不受影響[15, 20-23]。

3.1選擇肝臟特異性的miRNA靶序列 在肝臟中特異性表達的miRNA有miR-122、miR-1、miR-16、miR-27b、miR-30d、miR-126、miR-133、miR-143及l(fā)et-7等，其中成年人肝臟中miR-122的表達量最高，達到肝臟所有miRNA含量的70%；每個肝細胞miR-122的拷貝數(shù)最高達66 000個，這也是所有細胞中表達量最高的miRNA[14,24]。根據(jù)Brown等[25]的研究結果，miRNAs的豐度必須達到100拷貝/pg總小RNA以上才能有效調控靶基因的表達，而MiR-122的豐度已遠遠超過這個界值。將肝特異性miR-122的靶序列插入到腺病毒早期基因E1A的3′UTR中，構建條件復制型腺病毒，此方法遏制了腺病毒在肝臟細胞中的復制[20-23]。

Cawood等[22]將4個拷貝的miR-122靶序列加入E1A基因表達盒的3′UTR區(qū)，結果發(fā)現(xiàn)，加入miR-122靶序列的小鼠肝臟中E1A的表達量減少(表達1/80)，病毒基因組拷貝數(shù)減少(表達1/50)，基本廢除了肝臟毒性。

Suzuki等[21]在腺病毒熒光素酶基因表達盒的3′UTR分別加入4個拷貝的miR-122靶序列和miR-122的對照靶序列，構建了Ad-L-122aT和Ad-L-controlT。體外實驗顯示，Ad-L-122aT在高表達miR-122的人高分化肝癌細胞系Huh7和原代培養(yǎng)的鼠肝臟細胞中，熒光素酶的表達量約為對照病毒的1/3和1/70，而在低表達miR-122的人肝癌細胞系SKHEP-1和鼠胰島內皮細胞系MS1中，熒光素酶的表達量并無明顯變化[21]；體內實驗顯示，與對照病毒Ad-L-controlT相比，小鼠瘤內注射病毒，瘤內熒光素酶的表達量無明顯變化，而小鼠肝臟中Ad-L-122aT的熒光素酶表達量則明顯減少，減少到對照病毒Ad-L-controlT 的1/1500~1/50[21]。

3.2選擇加入合適拷貝數(shù)的miRNA靶序列 在腺病毒早期基因3′UTR到polyA間插入miRNA靶序列的調控元件需要確定加入miRNA靶序列拷貝數(shù)。合適拷貝數(shù)的加入既可以兼顧腺病毒可加入外來基因的容量、減少實驗的復雜性，又可有效吸附miRNA。

Cawood等[23]構建了由巨噬細胞病毒(cytomegalovirus, CMV)啟動子控制的腺病毒熒光素酶基因報告載體pcmv-luc-mir，其分別插入0個、4個、8個拷貝的miR-122靶序列和4個拷貝的miR-122反義靶序列，評估這些載體在體外鼠肝細胞中的復制能力。結果表明，插入4個拷貝的miR-122靶序列的腺病毒有明顯抑制效果，而插入8個miR-122靶序列并不比插入4個靶序列的遏制效果明顯。插入4個反義miR-122靶序列的載體不改變熒光素酶的活性。研究還比較了野生型腺病毒Ad5WT與加入miR-122的Ad5-mir122在Balb/C小鼠基因組中的復制和肝臟毒性，結果發(fā)現(xiàn)，與野生型Ad5WT相比，Ad5-mir122能明顯降低腺病毒基因組在小鼠肝臟內的復制，并降低肝臟毒性，同時還提高了動物對病毒的最大耐受量，Ad5-mir122最大耐受量可達到9×109～1.8×1010pfu/鼠。研究還另外證實，加入4個拷貝的miR-122靶序列明顯比加入3個拷貝靶序列更有效[23]。

Cawood等[23]在5型野生型腺病毒E1A基因的3′UTR處加入4個拷貝的miR-122靶序列，構建了Ad5micr122，有效控制了腺病毒在鼠肝臟中復制。Zhang等[26]在Ad6早期基因E1A的3′UTR加入4個拷貝的miR-122的靶序列，選擇性治療去勢前列腺癌，其有效降低了肝臟毒性，提高了治療劑量，增強了全身的抗癌效果。

3.3miR-122調控基因表達模式降低肝臟毒性的嚴謹性

3.3.1加入miR-122靶序列得到的遏制作用是由miR-122特異性介導的Yl?sm?ki等[20]將一段異位序列(ACCAUGG)插入到Ad5/3E1A mRNA的5′UTR，產生新的腺病毒Ad5/3K與Ad5/3相比，E1A水平降低，但并未影響病毒復制。在Ad5/3K基礎上又構建了新的腺病毒Ad5/3K-122，即在Ad5/3K復制早期必需基因 E1A的3′UTR加上3個拷貝的miR-122 靶序列，其感染肝臟細胞Huh7后，Ad5/3K-122組難以檢測到E1A和其他腺病毒蛋白；而在Ad5/3K組，E1A和其他腺病毒蛋白的表達水平有增加的趨勢[20]。在低表達miR-122 的肺癌細胞系A549中，兩組E1A和其他腺病毒蛋白的表達量并無明顯差異[20]。Huh7和A549細胞實驗共同證明了Ad5/3K-122復制的大量減少是由miR-122介導的。同時該研究還轉染了miR-122的抑制物到Huh7細胞中，遏制了miR-122靶序列的影響，證明靶序列的遏制能力的確是由miR-122介導的[20]。插入miR-122靶序列是一個非常有效的遏制腺病毒在肝臟中復制并降低肝臟毒性的策略，其并不影響腺病毒在其他類型細胞中的復制能力。

Cawood等[22]構建了一組分別插入不同拷貝的miR-122靶序列和插入4個拷貝miR-122的反義靶序列的pcmv-luc-mir 載體，結果發(fā)現(xiàn)，插入miR-122靶序列的載體熒光素酶活性明顯降低，而插入4個反義miRNA靶序列的載體不能改變熒光素酶的活性。在此基礎上，又構建了腺病毒載體AD-E1A-luc 和AD-E1A-luc-mir122(包含4個miR-122的靶序列)分別感染miR-122陰性細胞A549、OVCAR-3和陽性細胞Huh7，結果發(fā)現(xiàn)，AD-E1A-luc-mir122的復制只在陽性細胞Huh7中得到遏制[22]；注射上述病毒到Balb/C 小鼠肝臟中，AD-E1A-luc-mir122的復制也得到有效遏制[22]。另外，在A549中加入miR-122的類似物，結果AD-E1A-luc-mir122的復制同樣得到了遏制，而AD-E1A-luc的復制不受影響[22]。以上研究證明上述遏制作用是由miR-122介導的。

Suzuki等[21]在熒光素酶基因表達盒的3′UTR加入4個拷貝的靶序列，構建出Ad-L-122aT，接著又構建了Ad-L-controlT，即把miR-122的靶序列換成對照序列。研究結果表明，腺病毒中的miR-122靶序列能明顯抑制轉基因的表達而不改變轉基因在腫瘤內的轉導。

3.3.2miRNA介導的調控不改變組織細胞中內源性miRNA和miRNA靶標mRNA的量Cawood等[23]在Ad5WT復制早期必需基因的3′UTR加入4個拷貝的miR-122靶序列，其構建的Ad5micr122能有效地遏制E1A在鼠肝臟細胞中的復制，同時研究證明這種方法并未改變miRNA的總量和miR-122內源靶標mRNA的穩(wěn)定性。

3.3.3插入miR-122靶序列的腺病毒是否會通過突變逃逸對其的遏制作用插入miR-122靶序列的腺病毒是否會通過突變靶序列逃逸這種遏制將決定這種調控模式的成敗。Yl?sm?ki等[20]觀察了感染CRAds的Huh7細胞2周后未發(fā)現(xiàn)突變，猜想即使存在突變，這個過程可能也是一個緩慢的過程，在腺病毒被免疫系統(tǒng)清除前不會發(fā)生。那么miR-122靶序列對肝細胞中腺病毒復制的遏制是完全可以達到的。

4應用正常組織與腫瘤組織差異表達的miRNA降低腺病毒對正常組織細胞的毒性

Kawashima等[27]和Taki等[28]的實驗表明，傳統(tǒng)的端粒酶啟動子特異的完全復制腺病毒(telomerase-specific replication-competent adenovirus，TRAD)感染原代纖維母細胞3 d后，腺病毒基因組會增加大約100倍，也就是說端粒酶啟動子的特異性和嚴謹性是相對的，所以在應用特異性啟動子的基礎上，采取進一步措施阻止腺病毒在正常細胞中的復制顯得尤為重要[15]。

在正常細胞中高表達而在腫瘤組織中低表達的miRNA有miR-143、-145、-199及l(fā)et-7等[16-17]，其中對let-7的研究較多。let-7在很多癌細胞中的表達都是下調的，如直腸癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、惡性黑色素瘤、淋巴瘤及急性淋巴細胞白血病等。Edge等[29]在野生型口腔皰疹病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)復制早期必需蛋白基質蛋白(matrix protein,M)3′UTR分別插入3個拷貝的let-7a靶序列、與let-7a無堿基互補配對的序列以及與let-7a部分堿基互補配對的序列，構建VSVlet-7wt，VSVlet-7mut和VSVlet-7mm。口腔皰疹病毒對siRNA和miRNA介導的遏制非常敏感。研究證實，這種加入靶序列的方法大量遏制了VSV M 基因在正常人原代纖維原細胞系GM38中的表達，但在人肺癌細胞系A549中的復制不受影響，而且該方法不影響病毒基因組的基因[29]，提示miRNA的調控模式在降低病毒對正常細胞的毒性方面是有效的。

Jin等[30]在Ad5/11的E1A 3′UTR分別加入8個拷貝的let-7靶序列和let-7靶序列的突變序列，構建了條件復制型腺病毒SG7011let7T和SG7011let7MT，通過蛋白印跡法和逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測E1A蛋白的表達。相對于WAd5和SG7011let7MT，在正常肝臟細胞系L-02和正常胚胎肝臟細胞系WRL-68中，SG7011let7T的復制被大量遏制，其明顯減輕了肝臟毒性，且不改變腺病毒在肝癌細胞系(HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5、Huh7)中的溶瘤效果。

神經元特異性的miRNA7在正常腦組織中高表達，但在神經膠質瘤中的表達顯著下調[31-32]。利用此特性，Leber等[33]在蕁麻疹病毒(measles viruses, MV)中由CMV啟動子控制的融合蛋白基因F 3′UTR中加入miRNA7的靶序列，構建出MV-EGFPmiR-7。小鼠體內實驗證實，MV-EGFPmiR-7既保證了小鼠皮下異種移植神經膠質瘤內的溶瘤效率，維持了其抗腫瘤活性，也明顯抑制了該病毒在正常神經組織中的復制，顯著降低了小鼠感染蕁麻疹病毒致死的風險[33]。

5應用肝特異性miRNA和差異表達的特異性miRNA提高腺病毒的安全性

用于構建傳統(tǒng)條件復制型腺病毒的組織特異性啟動子的嚴謹性是相對的。利用hTERT調控E1A基因構建的受端粒酶活性調控的復制型腺病毒(telomerase-specific replication-competent Ad，TRAD)以低劑量(2 MOI)感染人肺纖維原細胞Wl-38，腺病毒基因組的拷貝數(shù)很低；但劑量提高到10 MOI時，病毒感染3 d后，Wl-38中病毒基因組的拷貝數(shù)仍會有500倍的增加[15]。病毒注射時，局部正常細胞周圍的病毒濃度很可能達10 MOI，雖然正常細胞感染量不是很大，但TRADs的E1A蛋白和E4蛋白經各種機制也會影響正常細胞的功能。為了降低TRAD對正常細胞的毒性，Sugio等[15]在腺病毒復制早期必需基因E1的3′UTR區(qū)分別插入4個拷貝的miR-143、-145、-199a或let-7a識別的靶序列，構建了一組受端粒酶活性和miRNA雙調控的TRAD。用RT-PCR定量檢測病毒基因組拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn)，這些插入特定序列的TRADs與傳統(tǒng)的TRADs相比，具有相同的溶瘤能力，但其在培養(yǎng)的正常細胞系和原代細胞中的復制能力明顯降低，僅是傳統(tǒng)TRADs復制量的1/1000左右[15]。

為了遏制腺病毒在肝臟細胞中的復制，降低其對肝臟的毒性，進一步構建了一個同時包含miR-122和miR-199識別靶序列的重組腺病毒TRAD-122a/199aT。TRAD-122a/199aT在正常細胞(W138、NHLF、PrSC、Nhep及SAEC)以及高表達miR-122的Huh7細胞中，E1基因的表達相對于傳統(tǒng)TRAD E1基因的表達效率減少(表達1/50~1/10)；而在肺癌腫瘤細胞A549、人結腸癌細胞系 HT29、人非小細胞肺癌細胞系H1299以及肝癌細胞HepG2與傳統(tǒng)TRAD中E1A基因的表達無顯著區(qū)別[15]。TRAD-122a/199aT應用肝臟特異性miR-122 及腫瘤與正常組織差異表達的micro199同時調控E1基因表達的策略，進一步提高了腺病毒的安全性[15]。

6小結

隨著越來越多組織特異性miRNA的發(fā)現(xiàn)，應用miRNA 調控腺病毒復制的策略將越來越成熟，聯(lián)合應用各種方法，針對特定情況多層次控制腺病毒復制，以達到最大治療效果和最低毒副作用將仍是這個領域的主要研究方向。

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Building Safer Adenovirus by Using of Tissue-specific MicroRNAWANGRong-hua,WANGHui-ping.(ExperimentalResearchCenter,theFirstPeople′sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200080,China)

Abstract:Oncolytic adenovirus has been considered as one of the most potential agents for cancer treatment,though in the process of application,it is still associated with serious toxic and side effects,especially hepatotoxicity.For the purpose of better aiming at the target,oncolytic adenovirus with better safety and effect is needed to be prepared.In recent years,many scientists utilized microRNA-regulated gene expression system to build safer and effective adenoviruses.Several copies of complementary sequences for tissue or cell-specific microRNAs are incorporated into the 3′-untranslated region of the E1 gene expression cassette to control post-transcriptional adenovirus replication.This strategy can effectively eliminate the toxic and side effects and significantly improve the safety profiles.

Key words:Neoplasms; Adenoviridae; MicroRNAs

收稿日期：2014-03-20修回日期：2015-05-30編輯：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.008

中圖分類號：Q782；R373.9

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)22-4053-04