謝良才，劉天春(綜述)，范 文※，許 蓉(審校)

(長(zhǎng)江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科，b.骨外科，湖北荊州434000)

類風(fēng)濕因子(rheumatoid factors，RF)是一種臨床常見的自身抗體，常作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的重要診斷指標(biāo)之一［1］，但同樣出現(xiàn)在其他自身免疫性疾?。?-3］、感染性疾?。?-4］，甚至健康人血液中［5］。RF是常見的免疫測(cè)定干擾物之一［3］，盡管RF對(duì)免疫檢測(cè)的干擾發(fā)生率并不高，但RF干擾的潛在性和嚴(yán)重危害性應(yīng)引起實(shí)驗(yàn)室工作人員和臨床醫(yī)師的足夠重視和警覺。目前相關(guān)研究多限于臨床個(gè)案的分析和報(bào)道，現(xiàn)主要闡述RF對(duì)各類不同種類的免疫測(cè)定干擾產(chǎn)生的機(jī)制及不同的干擾類型，同時(shí)闡述干擾的發(fā)現(xiàn)、鑒別、處理及減少RF干擾發(fā)生的措施，為消除或減少RF對(duì)免疫檢測(cè)的干擾提供參考。

1 RF對(duì)免疫測(cè)定的干擾

1.1 RF干擾的檢測(cè)項(xiàng)目 RF對(duì)許多免疫測(cè)定項(xiàng)目存在干擾。內(nèi)分泌類:甲狀腺激素［6］、甲狀旁腺激素［7］;腫瘤標(biāo)志物:糖類抗原 19.9［8］、糖類抗原 125［9］;心肌標(biāo)志物:腦鈉肽［10］、肌鈣蛋白Ⅰ［11］;特異性微生物標(biāo)志物:乙型肝炎表面抗原［12］、丙型肝炎病毒抗體［13］、風(fēng)疹特異性免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M 抗體［14］、結(jié)核分枝桿菌抗體［15］;其他:細(xì)胞因子［16］、C 反應(yīng)蛋白［17］及一些藥物［18］等。

1.2 對(duì)雙抗體夾心法免疫檢測(cè)的干擾

1.2.1 正干擾(假性增高/假陽性) 雙抗體夾心法用于大部分抗原、蛋白、激素及藥物的檢測(cè)。研究證實(shí)，RF對(duì)基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附法［12，19］、固相放射免疫［14］、化學(xué)發(fā)光法［10，20-21］、微粒子免疫分析［22］等檢查系統(tǒng)，均存在不同程度的正性干擾。RF對(duì)雙抗體夾心法檢測(cè)系統(tǒng)干擾的可能機(jī)制為:雙抗體夾心法檢測(cè)系統(tǒng)中的捕獲抗體和信號(hào)抗體一般均為IgG，當(dāng)樣本中的RF能同時(shí)與這兩種抗體Fc段結(jié)合時(shí)，便會(huì)將捕獲抗體與信號(hào)抗體橋接，形成捕獲抗體-RF-信號(hào)抗體的復(fù)合物，從而產(chǎn)生非特異性的檢測(cè)信號(hào)，造成檢測(cè)結(jié)果的假性增高或假陽性［16，19］，引起這種干擾的可能是IgM-RF、IgG-RF或者其他型別。

1.2.2 負(fù)干擾(假性降低/假陰性)RF對(duì)雙抗體夾心法的免疫分析系統(tǒng)的負(fù)干擾在一些文獻(xiàn)中被提出［23］，但被試驗(yàn)或臨床證實(shí)的報(bào)道較少［19，24-25］。RF對(duì)免疫測(cè)定系統(tǒng)負(fù)干擾的機(jī)制，主要是空間位阻(屏蔽)假說［25］，即當(dāng)RF只能與捕獲或信號(hào)抗體中的某一種抗體結(jié)合時(shí)，會(huì)形成空間位阻(屏蔽)，阻礙捕獲抗體-抗原-信號(hào)抗體復(fù)合物的形成，造成檢測(cè)信號(hào)的減弱或缺失，引起假性降低或假陰性的檢測(cè)結(jié)果［24-25］。對(duì)于一些三位點(diǎn)免疫檢測(cè)法，其干擾發(fā)生的機(jī)制與雙抗體夾心法是相似的。由于同時(shí)使用兩種捕獲抗體(或兩種信號(hào)抗體)，雖然增加了檢測(cè)的敏感性，但同時(shí)也增加了干擾發(fā)生率。

1.3 RF對(duì)捕獲法檢測(cè)IgM類抗體的干擾 捕獲法檢測(cè)IgM的干擾目前僅見假性增高的報(bào)道［13-14］，是否有假性降低的可能尚有待進(jìn)一步研究。RF對(duì)捕獲法干擾有兩種可能的機(jī)制，一種是由IgM-RF引起，由于第一步IgM的捕獲是非特異性的，IgM-RF同樣被捕獲，被捕獲的IgM-RF最后與信號(hào)抗體(IgG或IgG的抗原抗體復(fù)合物)結(jié)合，產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào);另一種機(jī)制則與雙抗體夾心法類似，由RF直接將捕獲抗體和信號(hào)抗體橋接，同樣會(huì)引起假性增高或假陽性。這兩種機(jī)制由哪一種主導(dǎo)目前尚缺乏相關(guān)研究和報(bào)道。

1.4 RF對(duì)其他免疫測(cè)定的干擾 RF干擾免疫比濁法和乳膠光度免疫分析法也有報(bào)道，RF對(duì)免疫比濁法干擾機(jī)制主要是發(fā)生在反應(yīng)的第二步，增加抗原抗體復(fù)合物聚集形成多聚體，引起檢測(cè)結(jié)果的假性增高［17］。

2 RF對(duì)免疫測(cè)定系統(tǒng)的干擾特點(diǎn)

2.1 干擾的發(fā)生具有隨機(jī)性 RF對(duì)免疫測(cè)定系統(tǒng)的干擾是由RF與檢測(cè)系統(tǒng)中抗體(主要是IgG)Fc段的非特異性結(jié)合引起的，但這種非特異性的結(jié)合并不是絕對(duì)的。某一個(gè)體，RF的干擾沒有規(guī)律可循。而其中的原因可能與RF自身的特異性和同系的特異性有關(guān)，一種RF不能與所有的IgG分子Fc部分的抗原結(jié)合，只有當(dāng)RF抗原的決定簇與IgG分子上Fc段對(duì)應(yīng)的空間結(jié)構(gòu)有互補(bǔ)性時(shí)才有可能結(jié)合，所以RF與IgG Fc段的結(jié)合是隨機(jī)的，沒有結(jié)合規(guī)律可循。因此，某一標(biāo)本中的RF是否能夠引起檢測(cè)系統(tǒng)的干擾，事前無法預(yù)料到［26］。

2.2 干擾程度與RF濃度的劑量效應(yīng)不明確 無論高濃度還是低濃度的RF均會(huì)對(duì)免疫檢測(cè)引起干擾。盡管某些研究證實(shí)高濃度的RF較低濃度的RF更易引起干擾，但干擾發(fā)生與RF濃度的量效關(guān)系目前尚不明確［24-26］。一方面是由于RF本身有IgM、IgG、IgA、IgD、IgE等多種成分，干擾是由哪種或哪幾種成分引起，各種成分的干擾效果等均有待進(jìn)一步研究;另一方面是由于RF能夠自身發(fā)生聚集，而形成多聚體;另外，RF可與天然IgG反應(yīng)，但與凝集IgG及免疫復(fù)合物中變性IgG親和力更強(qiáng)［24］。因此，干擾程度可能與分析物濃度也有一定的相關(guān)性(因?yàn)檫@些分析物會(huì)與檢測(cè)系統(tǒng)抗體形成抗原抗體復(fù)合物)［26］。

3 干擾的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)

3.1 追溯用于檢測(cè)干擾抗體的存在 結(jié)果追溯是指當(dāng)化驗(yàn)結(jié)果受到質(zhì)疑(因與臨床結(jié)果不符或超過極端限制的分析結(jié)果)時(shí)，在發(fā)出報(bào)告結(jié)果之前，依據(jù)完善的機(jī)制或程序，追索確認(rèn)干擾的存在［27］。干擾的可能性應(yīng)始終考慮，即使在管理最好的實(shí)驗(yàn)室，尤其當(dāng)結(jié)果出現(xiàn)與臨床表現(xiàn)不符合時(shí)，早期的調(diào)查始終是可取的［28］。追溯方法有明顯的缺點(diǎn)，比如很多檢測(cè)結(jié)果本身病理、生理下會(huì)出現(xiàn)大的生物學(xué)差異，缺乏充分的臨床資料及臨床表現(xiàn)的復(fù)雜性。因此，利用生理學(xué)上不合理的閾值做判斷，提醒技術(shù)人員所有免疫檢測(cè)的潛在干擾是不實(shí)際的。

3.2 積極的用于確認(rèn)干擾抗體存在的方法

3.2.1 樣本連續(xù)稀釋法 通過對(duì)分析樣本進(jìn)行連續(xù)稀釋，分析稀釋系數(shù)與濃度梯度改變的線性關(guān)系，是較為簡(jiǎn)單、可行的用于干擾發(fā)現(xiàn)和鑒別的方法［10，29］。例如，有報(bào)道，利用稀釋法可較好地消除由于異嗜性抗體引起的雅培化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定血清人絨毛膜促性腺激素的干擾［30］。

3.2.2 加標(biāo)或加樣回收實(shí)驗(yàn) 加標(biāo)或加樣回收實(shí)驗(yàn)也可鑒定和確認(rèn)干擾的存在與否［29］。通過向檢測(cè)樣本中加入已知量的分析物，計(jì)算回收率，如果回收率在檢測(cè)系統(tǒng)預(yù)定回收率范圍內(nèi)，可排除干擾的存在;如果回收率遠(yuǎn)高于檢測(cè)系統(tǒng)正?；厥章剩崾緳z測(cè)結(jié)果偏高，樣本檢測(cè)結(jié)果可能存在假性增高;如果回收率遠(yuǎn)低于檢測(cè)系統(tǒng)正常回收率，提示檢測(cè)結(jié)果偏低，樣本檢測(cè)結(jié)果可能存在假性降低［10］。

3.2.3 使用不同方法學(xué)或不同廠商的檢測(cè)系統(tǒng)復(fù)查 使用不同方法學(xué)或不同廠商的檢測(cè)系統(tǒng)復(fù)查，尋找與測(cè)量的替代方法之間的差異［27，31］。由于RF對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的干擾是偶然的，不同檢查系統(tǒng)試劑中使用的抗體有一定的差異，因此同一樣本對(duì)一種檢測(cè)系統(tǒng)有干擾，但對(duì)另一檢測(cè)系統(tǒng)干擾不一定存在。所以對(duì)于一些樣本，尤其是當(dāng)初次檢測(cè)結(jié)果與臨床不符時(shí)，可采取更換檢測(cè)系統(tǒng)的方法復(fù)查樣本，以發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)干擾。

3.3 其他發(fā)現(xiàn)鑒別干擾存在的方法 對(duì)于在生理、病理、臨床上有相關(guān)性的項(xiàng)目(如肌酸激酶及其同工酶與肌鈣蛋白、乙型肝炎e抗原與乙型肝炎表面抗原等)，比較相關(guān)檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果之間的一致性也是發(fā)現(xiàn)干擾的方法之一。另一種積極的做法是要求提供相關(guān)病史(如風(fēng)濕病史)。實(shí)施這一方法也較為困難，且很可能是無效的，因?yàn)樵谖粗蓴_發(fā)生率、程度及干擾物量效關(guān)系等信息時(shí)，很難預(yù)測(cè)干擾發(fā)生與否。對(duì)所有待檢樣本進(jìn)行盲篩也是不可取的。實(shí)驗(yàn)室和臨床工作人員之間應(yīng)建立良好的溝通，以最大限度地減少因意料之外的干擾而造成錯(cuò)誤檢測(cè)結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。

4 干擾的處理

4.1 樣本前處理 在檢測(cè)和分析前對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理以消除或盡可能降低樣本中的RF，以達(dá)到消除或降低RF對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的干擾。常用的樣本預(yù)處理方法包括:分析前在樣本中加入動(dòng)物血清或 IgG［7，19］或加入封閉阻斷試劑［32］;用包被IgG 的 固 體 顆 粒 吸 附［10，26］;使 用 阻 斷 試 管 采 集 檢 測(cè) 樣本［23，33］;使用聚乙二醇 6000［34］處理樣本，這樣的選擇有一個(gè)很好的理由，因?yàn)榕cIgG結(jié)合形成復(fù)合物而干擾免疫檢測(cè)的RF主要成分被認(rèn)為是多克隆IgM型RF，而與聚乙二醇6000沉淀的主要是此類較大的復(fù)合物，而對(duì)其他小分子單體RF沉淀很少;用蛋白L沉淀［16，35］，但價(jià)格較高，使得L蛋白不可能用于臨床試驗(yàn)。盡管這些方法在減少或消除RF干擾方面被證實(shí)是有效的，且其中一些方法也較為簡(jiǎn)單實(shí)用，但這些預(yù)處理方法已被證實(shí)并不是對(duì)所有RF樣本都有效［19，26，36］。

4.2 改進(jìn)檢測(cè)系統(tǒng) 利用抗體工程，在免疫測(cè)定中截?cái)郌c部分(RF的結(jié)合位點(diǎn))，僅保留Fab段的抗體作為檢測(cè)試劑，或使用活體的生物素單鏈?zhǔn)且粋€(gè)較為理想的解決RF干擾的方法［37-39］。但檢測(cè)系統(tǒng)中，無論是捕獲抗體的包被固化，還是信號(hào)抗體的標(biāo)記，多在抗體的Fc段，這樣的修改可能增加抗體的包被和標(biāo)記的難度，在工程上依然有一定的困難，因此，目前市場(chǎng)上也無此類檢測(cè)系統(tǒng)，但其可能成為今后抗體免疫檢測(cè)抗干擾研究的方向之一［37］。也有報(bào)道，RF不與卵黃抗體反應(yīng)，如果將捕獲抗體或信號(hào)抗體(或兩者)使用卵黃抗體，能夠避免 RF 的干擾［40］。

5 小結(jié)

盡管對(duì)RF免疫檢測(cè)干擾的研究有了很大的進(jìn)步，并提出很多干擾鑒定和解決的方法，但到目前為止還沒有一種方法可徹底消除RF的干擾。當(dāng)出現(xiàn)與臨床不符的可疑結(jié)果時(shí)，檢驗(yàn)人員應(yīng)立即告知實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人，及時(shí)與臨床聯(lián)系，尋找干擾原因，運(yùn)用多種檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，力求得出較為準(zhǔn)確的結(jié)果。相信隨著RF相關(guān)干擾的進(jìn)一步研究及免疫檢測(cè)技術(shù)、抗體工程技術(shù)的發(fā)展，在不久的將來能徹底解決由此帶來的困擾。

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