楊　慧，王曉楠(綜述)，丁　磊，封國生(審校)

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院腫瘤中心，北京 100038； 2.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院普外科，北京 100020)

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分子生物醫(yī)學

Claudin家族基因剔除小鼠表型的研究進展

楊慧1△，王曉楠1△(綜述)，丁磊1※，封國生2(審校)

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院腫瘤中心，北京 100038； 2.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院普外科，北京 100020)

摘要：密封蛋白(Claudin)是細胞間緊密連接的骨架蛋白，參與維持緊密連接的各種功能，其異常表達可破壞上皮細胞及內皮細胞的結構，導致其功能嚴重受損。近年來，關于Claudin基因不同生理作用的研究越來越受到人們的關注，基因剔除技術將在整體動物水平研究基因功能成為可能。該文就Claudin家族基因剔除后的小鼠表型進行綜述，旨在了解Claudin基因的生理功能。

關鍵詞：緊密連接；密封蛋白；基因剔除；小鼠；表型

緊密連接是細胞黏附的4種連接形式之一，存在于機體的上皮細胞和內皮細胞間，位于連接復合體的最頂端，同黏附帶、縫隙連接和橋粒共同組成了細胞連接。緊密連接具有特有的柵欄功能和屏障功能，柵欄功能是指緊密連接像柵欄一樣連續(xù)地環(huán)繞細胞頂端，阻止上皮細胞頂側膜和基底外膜中不同分子的相互混合，對保持細胞的極性具有重要作用；而屏障功能在控制細胞間離子流和維護組織內穩(wěn)態(tài)上起重要作用。此外，緊密連接還參與細胞運動、增殖和分化以及信號轉導過程。緊密連接主要由密封蛋白(Claudin)、閉合蛋白和連接黏附分子3種膜蛋白及閉合小環(huán)蛋白等胞質蛋白組成，其中以Claudin的功能最為重要。現(xiàn)就Claudin家族基因剔除后小鼠表型的研究進展予以綜述。

1Claudin蛋白概述

Claudin蛋白是一類相對分子質量為20 000～27 000的跨膜緊密連接蛋白，目前至少已發(fā)現(xiàn)Claudin家族的24個成員[1]。它們具有相同的分子結構，由4個跨膜結構域、2個胞外環(huán)及細胞質內的氨基和羧基組成(圖1)[2]。在不同的Claudin之間，第1和4跨膜區(qū)以及細胞外環(huán)的氨基酸具有高度保守性，第1個細胞外環(huán)決定緊密連接的跨膜電阻和細胞旁通路的選擇性，而緊密連接的結構與跨膜結構域及胞質部分有關。Claudin蛋白的羧基端具有潛在的磷酸化位點和PDZ(PSD-95/Dlg/ZO-1)結合序列，磷酸化能調節(jié)其在緊密連接復合體中的定位，而PDZ結合序列使Claudin蛋白可與緊密連接膜相關蛋白的鳥苷酸激酶同工酶及富含PDZ結構域的蛋白1結合，在信號轉導中發(fā)揮重要的作用[3]。

2不同Claudin基因剔除后的小鼠表型

2.1Claudin-1Claudin-1在大多數(shù)器官中表達，尤其高表達于肝臟和皮膚，Claudin-1基因剔除小鼠表現(xiàn)出皮膚的皺縮，出生后1 d死亡[4]。Furuse等[4]創(chuàng)建了Claudin-1基因剔除小鼠，通過剖宮產獲得第18.5日的胚胎，對這些小鼠進行復蘇，并進行體質量監(jiān)測，Claudin-1-/-小鼠表現(xiàn)出快速穩(wěn)定的體質量下降，皮膚明顯脫水、褶皺；經(jīng)皮水分實驗表明，Claudin-1-/-小鼠的表皮屏障嚴重受損，進而將一種包含生物素?；噭?557D)的等滲溶液注入Claudin-1+/+和Claudin-1-/-小鼠的后背，在Claudin-1+/+小鼠體內，示蹤物質由基底層向顆粒層滲透過程中，被緊密連接所阻滯；而在Claudin-1-/-小鼠體內，這種阻滯現(xiàn)象并未發(fā)生，示蹤物質穿透緊密連接到達顆粒層與角質層的邊界，說明Claudin-1對于小分子物質(約600)具有屏障作用。Sugawara等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-1-/-小鼠的角質層細胞變得粗糙、褶皺，表明Claudin-1-/-小鼠的角質層發(fā)生了形態(tài)學改變；通過對表層皮膚水合作用的研究，發(fā)現(xiàn)Claudin-1-/-小鼠的水合作用是下降的，其角質層喪失了保存水分的功能；進一步實驗表明，Claudin-1-/-小鼠角質層的屏障功能受損，其神經(jīng)酰胺組成也發(fā)生了顯著變化。在角質層細胞分化的末期，顆粒細胞很大程度轉化為角質細胞，伴隨細胞間脂質、角化包膜和角蛋白結構的形成，而這些過程均在緊密連接上層的細胞發(fā)生。而Claudin-1-/-小鼠顆粒層的緊密連接被破壞，以至于顆粒層-角質層界面的液體環(huán)境被破壞，致角質層細胞不能進行正常的分化，出現(xiàn)功能障礙[5]。這說明Claudin-1 不僅充當著阻滯細胞外液體的滲透屏障，而且通過分隔緊密連接下層的細胞外液體，對于建立顆粒層和角質層細胞分化的液體環(huán)境也充當著屏障功能。此外，Claudin-1在過敏性皮炎和牛皮癬患者體內的表達是下降的[6-7]。

2.2Claudin-2Muto等[8]通過傳輸參數(shù)實驗發(fā)現(xiàn)，Claudin-2+/+小鼠的細胞旁轉運電阻為(11.6±0.6) Ω·cm2，而Claudin-2-/-小鼠增高為(29.3±1.3) Ω·cm2，約是Claudin-2+/+小鼠的2.5倍；這使Claudin-2-/-比Claudin-2+/+小鼠的上皮細胞緊密性更高，導致Claudin-2-/-小鼠的腎臟對鈉離子、氯離子和水的重吸收嚴重減少；Claudin-2高表達于腎臟近曲小管，Claudin-2基因剔除小鼠的腎臟對鈉離子、氯離子和水的重吸收嚴重減少，其近曲小管對鈉離子、氯離子的選擇性喪失。此外，Rosenthal等[9]研究發(fā)現(xiàn)，將人的Claudin-2基因轉染至犬腎傳代細胞中，其跨膜電阻將降到一個較低的水平，并且與Claudin-2基因表達水平呈反比；進一步研究顯示，轉染了Claudin-2基因的犬腎傳代細胞對鈉離子和水的滲透性增強。

2.3 Claudin-5Nitta等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-5高表達于腦血管內皮細胞中，Claudin-5基因剔除小鼠血腦屏障嚴重受損，并在出生后10 h內死亡；同時發(fā)現(xiàn)，Claudin-5-/-小鼠的血腦屏障對于小分子物質(<800)的通透性受到了嚴重的影響；將一種相對分子質量為443的示蹤物打入左心室，5 min后，這種物質在Claudin-5-/-小鼠的腦實質中廣泛分布，而在正常小鼠并沒有進入血腦屏障，提示Caudin-5-/-小鼠的血腦屏障受損；而應用微過氧化物酶(約1900)進行實驗，Claudin-5-/-小鼠的腦實質中并沒有檢測到這種物質，表明血腦屏障對于分子的大小具有選擇性；進一步應用磁共振成像定量驗證了Claudin-5-/-小鼠血腦屏障的損害，通過心臟血管打入造影劑，正常小鼠的大部分器官(除中樞神經(jīng)系統(tǒng))被增強顯影，而Claudin-5-/-小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)顯著增強，并且顯影的程度與造影劑的劑量有關；在Claudin-5+/+小鼠中，大部分造影劑保留在腦血管內，約1%的造影劑跨膜轉運到血管外，而Claudin-5-/-小鼠中15%的造影劑溢出，并廣泛分布于神經(jīng)細胞的間隙中。

2.4Claudin-7Claudin-7在遠端腎單位高表達，與細胞旁氯離子的通透性有關[11]。Tatum等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-7基因剔除小鼠表現(xiàn)出鈉離子、氯離子、鉀離子的嚴重流失及慢性脫水和生長阻滯，并于出生后7～12 d死亡；Claudin-7基因剔除引發(fā)了一系列的代償變化，如醛固酮合酶的升高、腎素、血清糖皮質激素激酶1、鈉離子通道、鈉離子/氯離子協(xié)同轉運蛋白和水通道蛋白2的升高以及鉀通道蛋白的降低；Claudin-7-/-小鼠皮膚表現(xiàn)出明顯的皺縮，而經(jīng)皮水分丟失實驗未見異常，也就是說，其水分丟失是由腎臟功能障礙引起的；Claudin-7-/-小鼠出現(xiàn)氯離子重吸收障礙，小管液中的氯離子濃度升高，導致遠端腎單位負電荷容量增大，從而減少了鈉離子吸收；小管腔中NaCl濃度的升高造成了滲透性利尿，從而導致Claudin-7-/-小鼠的脫水；而細胞外液容量的減少又促進腎上腺皮質分泌醛固酮合酶，來代償NaCl的丟失；醛固酮的分泌增加了鉀離子的排泄，進而導致鉀通道蛋白的代償性降低。這些研究表明，Claudin-7 對于維持遠端腎單位NaCl的平衡是必需的，細胞旁離子轉運通道對于體內離子的穩(wěn)態(tài)也是不可或缺的。此外，Claudin-7基因在腸道中表達也較高，研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-7-/-小鼠腸道內可見嚴重的結構破壞，表現(xiàn)為黏膜潰瘍、上皮脫落和明顯的炎癥反應增生現(xiàn)象[13]。這些表現(xiàn)模擬了人類的潰瘍性結腸炎疾病模型，為人類疾病的研究提供了工具。

2.5Claudin-10Claudin-10基因可表現(xiàn)為兩個亞型，即Claudin-10a 和Claudin-10b。Claudin-10a在腎臟皮質中占主導地位，可以增加細胞旁通路對陰離子的轉運；而Claudin-10b在腎臟髓質中表達較高，影響細胞旁通路對陽離子的轉運[14]。Claudin-10b基因剔除小鼠表現(xiàn)為高鎂血癥和腎鈣質沉著癥，對鈉離子的細胞旁通透性降低，對鈣離子和鎂離子的相對滲透性升高[15]，表明Claudin-10b在控制髓袢升支粗段的陽離子選擇性和轉運過程中起重要作用。Breiderhoff等[15]通過硝酸銀和茜素紅染色顯示，Claudin-10b-/-小鼠的腎臟表現(xiàn)出廣泛的髓質鈣沉著，主要集中在外髓部的外條紋和外髓部向內髓部過渡的內條紋中；通過對小鼠尿液和血清參數(shù)進行分析，Claudin-10b-/-小鼠出現(xiàn)中等的多尿、多飲、尿液滲透壓的降低和酸性的增強；血清鎂離子濃度升高2倍，鎂離子的尿排泄分數(shù)降為對照組的52%；鈣離子的排泄分數(shù)輕度降低，但Claudin-10b-/-小鼠并未表現(xiàn)出高鈣血癥，相反卻表現(xiàn)為血清鈣的降低；進一步實驗表明，Claudin-10b-/-小鼠腎臟的其他Claudin蛋白發(fā)生了代償性變化，Claudin-16和Claudin-19分別增加了1.6倍和1.7倍，Claudin-14的表達增加了20倍，而Claudin-11的表達降低了75%。

2.6Claudin-11Claudin-11高表達于神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘和睪丸的支持細胞，Claudin-11基因剔除小鼠表現(xiàn)為雄性不育和神經(jīng)系統(tǒng)異常，包括減慢的中樞神經(jīng)傳導、微小的身體震顫和持續(xù)的下肢無力[16-17]。Mazaud-Guittot等[18]研究顯示，血睪屏障是由生精上皮的睪丸支持細胞產生的，血睪屏障將生精上皮分成兩個腔室，即基底室(精原細胞更新和繁殖的場所)和近腔室(未分化的生殖細胞進行減數(shù)分裂和精子形成的場所)；Claudin-11-/-小鼠出現(xiàn)生精上皮細胞的蛻皮和血睪屏障形成障礙，以至于精子不能正常形成，導致不育。此外，Claudin-11 在耳蝸血管紋的基底上皮細胞中也有表達，Claudin-11-/-小鼠出現(xiàn)耳聾，伴有耳蝸內電位的顯著降低[19-20]。耳蝸膜迷路充滿了內淋巴液，內淋巴液以較高的鉀離子濃度 (約150 mmol/L)和+90 mV的耳蝸內電位為特點，這些條件由血管紋產生，對于耳蝸毛細胞將聽覺刺激轉換為電信號是不可或缺的。血管紋由邊緣細胞和基底細胞組成，Kitajiri等[20]實驗發(fā)現(xiàn)，Claudin-11-/-小鼠血管紋基底細胞被破壞，而邊緣細胞并未受到影響；Claudin-11-/-小鼠耳蝸內電位降低至30 mV，而內淋巴液中鉀離子的濃度并未改變。這表明血管紋邊緣細胞的屏障功能對于產生和維持內淋巴液中較高的鉀離子濃是足夠的；而血管紋基底細胞對于聽覺過程中耳蝸內電位的產生和維持是必不可少的。

2.7Claudin-14Ben-Yosef等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-14高表達于耳蝸細胞，Claudin-14基因剔除小鼠也表現(xiàn)為耳聾；與Claudin-11-/-小鼠不同，Claudin-14-/-小鼠耳蝸內電位正常，其耳聾起因于耳蝸外毛細胞的迅速變性以及生命前3周的內毛細胞較慢的變性；Claudin-14-/-小鼠的外毛細胞功能喪失，并從基底側向頂端進展；外毛細胞起著機電耳蝸放大器的作用，可以增強40 dB的聽覺靈敏度，而Claudin-14-/-小鼠幾乎喪失了所有的外毛細胞，僅剩余一部分內毛細胞，聽力喪失了50～60 dB；外毛細胞的變性在出生后8～9 d表現(xiàn)出來，并與幾個重要的生理過程(包括內淋巴液鉀離子的增加和耳蝸內電位的發(fā)生)同時出現(xiàn)，而Claudin-14-/-小鼠耳蝸內電位正常，由此推測Claudin-14-/-小鼠外毛細胞的變性與外毛細胞基膜離子組成的改變有關；進一步實驗表明，在內耳的螺旋器中，網(wǎng)狀板的緊密連接使富含鉀離子的內淋巴液和富含鈉離子的外淋巴液分離，從而維持外毛細胞周圍液體的離子組成；而Claudin-14-/-小鼠網(wǎng)狀板的離子滲透性發(fā)生改變，導致外毛細胞基底側鉀離子濃度升高，從而破壞了外毛細胞的功能。

2.8Claudin-15Tamura等[22]通過組織學檢查發(fā)現(xiàn)，Claudin-15 高表達于小腸黏膜細胞，Claudin-15基因剔除小鼠上段小腸的長度和直徑是正常小鼠的2倍；小鼠的大體形態(tài)、血清成分和小腸的功能未見明顯異常；Claudin-15-/-小鼠上段小腸上皮細胞的腸絨毛尺寸是正常小鼠的2倍，由陷窩細胞數(shù)量增加和異常增殖導致；而Claudin-15-/-小鼠并未引起小腸中其他Claudin基因的代償性表達。另有研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-15對于小腸上皮細胞旁鈉離子的通透性、小腸管腔中鈉離子的平衡和葡萄糖的吸收是必不可少的[23]。

2.9Claudin-16Will等[24]研究表明，Claudin-16高表達于髓袢升支粗段，Claudin-16基因剔除小鼠表現(xiàn)為高尿鈣、低鎂血癥，伴隨尿液pH值降低；Claudin-16-/-小鼠髓袢升支粗段對鎂離子和鈣離子吸收障礙，而由于腎臟對鈣離子的丟失，引起甲狀旁腺激素和維生素D的代償性升高；同時，基因表達譜顯示，參與轉運鎂離子和鈣離子的離子通道轉錄上調。這些生理改變與人類的家族性低鎂、高尿鈣和腎鈣質沉著癥非常相似，對于人類疾病的研究提供了動物模型。另有Hou等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-16和Claudin-19具有協(xié)同作用，兩者中任何一個發(fā)生突變將導致同一效應的減弱；Claudin-16表達的降低將阻礙Claudin-19在緊密連接上的形成。

2.10Claudin-18Claudin-18高表達于破骨細胞，Claudin-18基因剔除小鼠表現(xiàn)為骨質疏松，伴隨全身骨密度、骨小梁體積和皮層厚度的降低[26]。Hayashi等[27]研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-18-/-小鼠胃液的pH值升高。為了探索骨質疏松是否由于胃液pH值升高引起鈣離子吸收減少，從而影響成骨過程所致，Alshbool等[26]用不同濃度的鈣飲食進行實驗，結果顯示，在給予正常鈣飲食的兩組小鼠中，Claudin-18-/-小鼠的血清鈣離子水平比對照小鼠顯著降低，而在給予高鈣飲食的兩組小鼠中，血清鈣離子水平?jīng)]有差別；進一步研究發(fā)現(xiàn)，在Claudin-18-/-小鼠中，給予高鈣飲食者比正常鈣飲食者血清鈣離子水平要高，而高鈣飲食并未緩解骨量的減少。由此得出，Claudin-18-/-小鼠胃液pH值升高導致鈣缺乏，高鈣飲食可以有效地糾正這一現(xiàn)象，但不能緩解Claudin-18-/-小鼠的骨質疏松表型。這個實驗驗證了Linares等[28]的研究結果，Claudin-18-/-小鼠骨量的減少來源于破骨細胞的功能障礙，并非成骨過程的破壞。

2.11Claudin-19Claudin-19高表達于腎臟和眼球細胞，Claudin-19 基因突變導致鎂離子的吸收障礙和嚴重的眼部病變，與Claudin-16基因剔除導致的腎表型難以分辨；Claudin-19基因突變還與人類的腎鈣質沉著癥有關，受累人群同時出現(xiàn)嚴重的視力損傷，表現(xiàn)為黏膜黃斑、近視和水平型眼球震顫[29]，說明Claudin-19對于維持正常的腎功能和視網(wǎng)膜的功能具有重要作用。此外，Claudin-19在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中高表達，構成施旺細胞的緊密連接；Claudin-19-/-小鼠表現(xiàn)出周圍神經(jīng)系統(tǒng)病變，電生理分析表明，Claudin-19影響小鼠外周有髓神經(jīng)纖維的神經(jīng)傳導，從而表現(xiàn)出行為異常；進一步通過“橫梁實驗”和“旋轉實驗”對小鼠進行行為檢測，驗證了Claudin-19-/-的神經(jīng)病變來源于周圍神經(jīng)系統(tǒng)[30]。

3小結

近年來，隨著Claudin基因剔除小鼠模型的建立，Claudin的生理功能更清楚地為人所知。然而，由于Claudin分布的廣泛，不同Claudin的結構、功能及其與其他物質間的相互關系尚未完全明確，Claudin蛋白在相關疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用機制仍不甚清楚。但從Claudin的角度研究疾病已成為熱點，并具有一定的臨床應用價值。相信隨著對Claudin生理功能的深入研究，人們將對Claudin蛋白有更加全面的認識，Claudin 在相關疾病的診斷、治療及預后等方面會有一個更廣闊的應用前景。

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Research Progress on the Phenotype of Mice after Knocking out Different ClaudinsYANGHui1，WANGXiao-nan1，DINGLei1，F(xiàn)ENGGuo-sheng2.(1.OncologyCenter,BeijingShijitanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100038,China; 2.DepartmentofGeneralSurgery,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

Abstract:Claudin is one of the important protein molecules of tight junction,involved in maintaining the functions of tight junction,and its abnormal expression can destroy the structure of epithelial cells and endothelial cells,leading to a serious damage to the function.In recent years,more and more people are paying attention to the physiological functions of the Claudin family.With the help of gene knocking out technology,it is possible to study the gene function on the whole animal level.Here is to make a review of the mice′s phenotype after knocking out different Claudins,to achieve a better understanding of the Claudins.

Key words：Tight junction; Claudin; Gene knock out; Mice; Phenotype

收稿日期：2014-12-12修回日期：2015-02-27編輯：鄭雪

基金項目：國家自然科學基金(81372585)；北京市教育委員會科技計劃面上項目(KM201410025026)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.001

中圖分類號：R332

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)18-3265-04