朱志堅(jiān)，陶　欣(綜述)，于燕妮(審校)

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550004)

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刺猬信號(hào)通路在氟中毒軟骨損害機(jī)制中的研究進(jìn)展

朱志堅(jiān)△，陶欣△(綜述)，于燕妮※(審校)

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550004)

摘要：氟在生理代謝過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用，適量的氟能促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育，但攝入過(guò)多將會(huì)引起一系列的中毒癥狀。氟骨癥是一種慢性骨關(guān)節(jié)病，其主要侵害四肢關(guān)節(jié)的軟骨、骨及骨周組織。刺猬(Hh)信號(hào)通路是一條經(jīng)典的胚胎發(fā)育和分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化增殖中起重要作用，且Hh信號(hào)通路中的許多因子直接對(duì)軟骨及骨的發(fā)育起調(diào)控作用。因此，Hh信號(hào)通路可能參與氟中毒軟骨損害的發(fā)病機(jī)制。

關(guān)鍵詞：地方性氟中毒；Hh信號(hào)通路；軟骨損害

地方性氟中毒是指長(zhǎng)期生活在高氟地區(qū)的居民通過(guò)飲水、食物和空氣等方式，使機(jī)體攝入過(guò)量的氟而導(dǎo)致的一種慢性全身性疾病；主要臨床改變分為骨相損害和非骨相損害，輕度氟骨癥只有患病關(guān)節(jié)疼痛的癥狀，而重度卻可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，甚至造成肢體殘廢。目前，地氟病的發(fā)病機(jī)制仍在研究中，近年來(lái)有大量學(xué)者通過(guò)各種信號(hào)通路來(lái)研究地氟病的發(fā)病[1-2]。刺猬(hedgehog，Hh)信號(hào)通路基因是一種分節(jié)極性基因，是Nusslein-Volhard和Wieschaus[3]在研究果蠅發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)的。正常情況下該通路對(duì)機(jī)體的生命活動(dòng)起重要調(diào)節(jié)作用[4-5]。外界刺激引起Hh信號(hào)通路的異常激活，參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[6-7]。現(xiàn)就Hh信號(hào)通路在氟中毒軟骨損害中的可能機(jī)制進(jìn)行綜述。

1Hh信號(hào)通路的主要成分、生物學(xué)特性及功能

Hh信號(hào)通路由Hh蛋白、靶細(xì)胞膜上兩種蛋白受體[修補(bǔ)蛋白受體(patched，Ptc)和七次跨膜蛋白受體(smoothened，Smo)]及三種鋅指轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2、Gli3組成[8]。在果蠅和其他無(wú)脊椎動(dòng)物中只有1種Hh基因，而在哺乳動(dòng)物中存在3種同源基因，即音速刺猬因子(sonic hedgehog，Shh)、印度刺猬因子(indian hedgehog，Ihh)及沙漠刺猬因子(desert hedgehog，Dhh)，編碼Shh、Ihh和Dhh蛋白。這三類蛋白均由N末端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，在N端結(jié)構(gòu)域端存在Hh蛋白的活性信號(hào)，而C端結(jié)構(gòu)域端則具有自身蛋白水解酶活性和膽固醇?；D(zhuǎn)移酶功能。在一定條件下，這3種Hh蛋白可相互代替，但它們均具有自己獨(dú)特的生理功能：Shh作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，在Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起主導(dǎo)作用，決定早期肢體的前后生長(zhǎng)及體部左右對(duì)稱模式；Ihh在軟骨及成骨細(xì)胞的分化過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用；Dhh在外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及生殖細(xì)胞的產(chǎn)生遷移中起調(diào)控作用[9]。Shh、Ihh和Dhh蛋白均為Hh前體蛋白，本身不具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，只有經(jīng)過(guò)棕櫚酰化后才能獲得活性。Hh信號(hào)通路的傳遞受靶細(xì)胞膜上Ptc和Smo兩種蛋白受體控制，Ptc蛋白由腫瘤抑制基因Patched編碼，由12個(gè)跨膜區(qū)的單鏈構(gòu)成，能與配體直接結(jié)合，在哺乳動(dòng)物中存在Ptch1和Ptch2兩種基因，Ptch1基因可對(duì)Hh信號(hào)起負(fù)調(diào)控作用，而Ptch2基因的轉(zhuǎn)錄可以不依賴于Hh信號(hào)通路[10]；Smo蛋白由原癌基因Smothened編碼，由7個(gè)跨膜區(qū)的單鏈構(gòu)成，其N端位于細(xì)胞外，C端位于細(xì)胞內(nèi)，該蛋白只有當(dāng)維持全長(zhǎng)時(shí)才具有啟動(dòng)下游靶基因的功能，當(dāng)被蛋白酶水解時(shí)，該蛋白可形成轉(zhuǎn)錄抑制子，抑制下游因子轉(zhuǎn)錄[11]。Hh信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心部位是含鋅指結(jié)構(gòu)，包括Gli1、Gli2和Gli3三個(gè)成員，其中，Gli1具有轉(zhuǎn)錄激活作用，且激活后的Gli1可通過(guò)正反饋加強(qiáng)Gli1的活化[12]；Gli2、Gli3蛋白均存在兩個(gè)功能區(qū)域，即C端的激活區(qū)域和N端的抑制區(qū)域，此兩區(qū)域的功能復(fù)雜，可在不同的環(huán)境中對(duì)Hh起激活或抑制作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Smo是Hh信號(hào)傳遞所必需的受體，當(dāng)Hh蛋白缺乏時(shí)，Smo蛋白與Ptc結(jié)合，從而抑制Smo的活性，使下游Gli蛋白在蛋白激酶A的作用下發(fā)生磷酸化，并在蛋白酶體內(nèi)將Gli蛋白截剪成小片段，使Gli以小片段的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而抑制下游目的基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)Hh蛋白存在時(shí)，Ptc與Hh結(jié)合，從而解除對(duì)Smo的抑制作用，促使Gli蛋白復(fù)合物與微管形成，使得Gli蛋白以全長(zhǎng)形式進(jìn)入核內(nèi)，進(jìn)而激活下游目的基因轉(zhuǎn)錄[12]。下游靶基因包括纖維生長(zhǎng)因子、骨形成蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子2、抗凋亡蛋白Bcl-2、細(xì)胞周期蛋白D1及Hh相互作用蛋白等[14]。研究發(fā)現(xiàn)，Hh信號(hào)通路能被一些小分子物質(zhì)(如：5E1、環(huán)杷明、GDC-0449等)特異性地抑制，這些小分子物質(zhì)可通過(guò)阻斷Hh與Ptch和(或)Smo的結(jié)合，從而阻斷Hh信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[14,16]。

2Hh對(duì)軟骨細(xì)胞的作用

Hh信號(hào)對(duì)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育起重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，去除Smo因子的軟骨細(xì)胞增殖速度明顯降低，相反，上調(diào)Smo的表達(dá)則可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖[16]。Shh對(duì)軟骨細(xì)胞的功能意見不一，有學(xué)者認(rèn)為Shh不僅能促進(jìn)軟骨間充質(zhì)細(xì)胞和前軟骨細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，也能抑制體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞肥大成熟[17]；但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的早期階段Shh表達(dá)量低，而到了軟骨細(xì)胞成熟階段Shh表達(dá)卻增加，因此認(rèn)為Shh具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞成熟肥大的功能[18]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在軟骨分化晚期可由骨形成蛋白進(jìn)行特異性調(diào)節(jié)[19]。在膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的患者中，Ihh蛋白及信使RNA的表達(dá)量較正常組高，且隨著軟骨破壞度加重，Ihh蛋白及信使RNA的表達(dá)量進(jìn)一步增加[20]。在膝關(guān)節(jié)炎大鼠模型中，Gli1、Ptch、Hh相互作用蛋白的表達(dá)量增加，而當(dāng)Smo基因被沉默或使用Hh特異性抑制劑處理時(shí)，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度減輕[21]。張杰等[22]的研究證明，漸進(jìn)性咬合紊亂促進(jìn)了大鼠髁突軟骨中Ihh及其受體Smo的高表達(dá)，而對(duì)Ptchl的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Campbell等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在軟骨肉瘤中Smo蛋白高表達(dá)，而使用Smo抑制劑(PI-926)降低Smo蛋白表達(dá)可明顯抑制肉瘤的增長(zhǎng)。這些研究成果均表明Hh信號(hào)通路不僅可調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育，還可參與軟骨病變的發(fā)生、發(fā)展。

3Hh信號(hào)通路在氟中毒軟骨損傷中的可能機(jī)制

3.1氟對(duì)軟骨細(xì)胞的影響研究發(fā)現(xiàn)，氟是參與膠原代謝密切的微量元素，機(jī)體攝入過(guò)量的氟能導(dǎo)致膠原代謝異常，而膠原蛋白是軟骨組織重要的成分之一，因此氟中毒時(shí)可影響軟骨代謝[24-26]。在低劑量氟時(shí)，可發(fā)現(xiàn)雙核的軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞內(nèi)線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)肥大，這些改變使軟骨細(xì)胞的代謝功能增強(qiáng)，以促進(jìn)細(xì)胞的增殖；而在高劑量氟時(shí)，卻可引起軟骨細(xì)胞核固縮凝聚成塊狀聚集在核膜周邊，線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)電子致密物下降，使其發(fā)生退行性變和髓樣變，并有凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)[27]。氟不僅可引起軟骨細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)的改變，還可引起軟骨組織的病理?yè)p害，表現(xiàn)為骺和關(guān)節(jié)軟骨深層的肥大軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，預(yù)備鈣化層不能鈣化；增厚的骺板軟骨細(xì)胞柱排列不整，干骺端血管侵入受阻，使關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞缺血壞死[28]。有研究者發(fā)現(xiàn)，小鼠飲用含高濃度氟化鈉的自來(lái)水后，軟骨基質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不均、方向不一的圓形或橢圓形裂隙，軟骨細(xì)胞層次排列不清，細(xì)胞數(shù)量減少，軟骨層變薄，骨小梁增寬，并可出現(xiàn)軟骨細(xì)胞的部分壞死，提示氟中毒時(shí)軟骨可出現(xiàn)不同程度的骨化，具有硬化性氟骨癥的病理改變[29]。目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為氟誘導(dǎo)的氧自由基學(xué)說(shuō)及細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)是研究氟中毒發(fā)病機(jī)制的經(jīng)典學(xué)說(shuō)。

3.2Hh信號(hào)通路與氟中毒氧自由基水平升高對(duì)軟骨的影響在正常情況下，活性氧自由基可由細(xì)胞代謝不斷產(chǎn)生與清除，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)活性氧自由基產(chǎn)生超過(guò)機(jī)體防御體系的清除能力或機(jī)體的防御體系不能正常發(fā)揮功能時(shí)，體內(nèi)氧自由基代謝就會(huì)出現(xiàn)失衡，即氧化應(yīng)激。氟是一種化學(xué)性質(zhì)極為活潑的元素，具有較強(qiáng)誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化的能力。氟中毒時(shí)，氟離子與抗氧化酶的活化中心結(jié)合，使抗氧化酶(如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶等)活性下降，而活性氧自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化物等指標(biāo)水平升高，導(dǎo)致機(jī)體氧化與抗氧化失衡，造成細(xì)胞損傷[30]。研究發(fā)現(xiàn)，用不同濃度的氟處理體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞后，在培養(yǎng)基中過(guò)氧化氫及一氧化氮水平隨氟濃度的增加而增加，而使用超氧化物歧化酶處理后，培養(yǎng)基中的氧自由基水平降低，表明氟可促進(jìn)軟骨細(xì)胞氧自由基的產(chǎn)生，而超氧化物歧化酶可減少或抑制氧自由基的產(chǎn)生[31]。并且，在氧自由基作用下，軟骨細(xì)胞柱出現(xiàn)長(zhǎng)度增加及橫徑變短等病理改變，說(shuō)明氟引起軟骨細(xì)胞損害與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)；軟骨細(xì)胞在氧自由基作用下還可使其分泌的Ⅱ型膠原轉(zhuǎn)變?yōu)棰裥湍z原，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞分化的異常[32]。研究表明，Hh信號(hào)通路與氧化應(yīng)激有著密切的聯(lián)系，機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷時(shí)可刺激Shh的釋放；同時(shí)，氧化應(yīng)激與Shh可發(fā)揮協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、丙二醛、Bcl-2和超氧化物歧化酶等的表達(dá)；且激活的Shh還可抑制Bax的表達(dá)，而促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)[33-34]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞給予氧化應(yīng)激系統(tǒng)刺激后，Shh蛋白及信使RNA的表達(dá)下降，當(dāng)使用維生素C和維生素E處理后，Shh蛋白及信使RNA的表達(dá)出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，提示了氧化應(yīng)激會(huì)引起Shh表達(dá)下降；研究還發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)機(jī)體分泌的Shh可利用Hh信號(hào)通路對(duì)星形細(xì)胞起到保護(hù)作用[35]。此結(jié)果均提示Hh信號(hào)通路可能參與氧自由基對(duì)軟骨細(xì)胞損害作用。

3.3Hh信號(hào)通路與氟中毒凋亡對(duì)軟骨的影響細(xì)胞凋亡是一種基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡方式，具有特征性形態(tài)和生化改變。凋亡的發(fā)生受到多種基因嚴(yán)格控制，包括胱天蛋白酶(caspase)家族、Bcl-2家族、癌基因(如c-myc、p53)和抑癌基因等。當(dāng)氟中毒時(shí)，過(guò)量氟引起自由基升高可直接作用于核酸，引起堿基修飾甚至DNA鏈的斷裂，進(jìn)而引起聚腺苷二磷酸核酸轉(zhuǎn)移酶的活化和p53的積累，引起細(xì)胞凋亡；同時(shí)，氟造成細(xì)胞膜通透的改變使細(xì)胞質(zhì)中鈣離子濃度增高，使鈣依賴caspase活性升高，進(jìn)而破壞細(xì)胞骨架，使細(xì)胞發(fā)生凋亡；并且，過(guò)量氟化物刺激體內(nèi)一氧化氮合酶的表達(dá)，造成一氧化氮產(chǎn)生過(guò)量，過(guò)量的一氧化氮激活促凋亡因子Bax，Bax引起線粒體釋放細(xì)胞色素C，而釋放的細(xì)胞色素C又可與凋亡蛋白激活子1結(jié)合，進(jìn)而激活啟動(dòng)型caspase(caspase-9)及執(zhí)行型caspase(caspase-3)，而caspase-3通過(guò)剪切蛋白后可進(jìn)入細(xì)胞核降解DNA鏈，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[36]。研究表明，許多參與細(xì)胞增殖、凋亡的效應(yīng)分子(如細(xì)胞周期蛋白D、細(xì)胞周期蛋白E、細(xì)胞周期蛋白B、Bcl-2、c-myc)被證明是Hh信號(hào)通路的下游分子[37]，因此Hh信號(hào)通路可利用這些分子對(duì)細(xì)胞的增殖及凋亡發(fā)揮調(diào)控作用。有報(bào)道，Gli3水解后可抑制Bcl-2啟動(dòng)子，促進(jìn)凋亡[38]；但也有研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2的順式調(diào)控區(qū)存在3個(gè)Gli2的結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可被Gli2識(shí)別，進(jìn)而選擇性地激活人類Bcl-2的啟動(dòng)子，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，以抑制細(xì)胞凋亡[39]。研究者通過(guò)RNA干擾技術(shù)對(duì)人食管癌細(xì)胞Smo因子沉默后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凋亡率明顯升高，此外還發(fā)現(xiàn)Shh可通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)和穩(wěn)定Bcl-2、Bcl-xL來(lái)保護(hù)胰腺導(dǎo)管細(xì)胞免受凋亡[40]。此結(jié)果均提示Hh信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的凋亡可起調(diào)控作用。

此外，Hh信號(hào)通路與Wnt、Ras、絲裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶等信號(hào)通路發(fā)生交聯(lián)，使Hh通路的調(diào)節(jié)和作用復(fù)雜化[41]，而這些信號(hào)通路均被證明參與了氟中毒的發(fā)病機(jī)制[42-43]。Hh信號(hào)通路與這些信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡以及氧化應(yīng)激之間的聯(lián)系密切，可能共同參與了地方性氟中毒軟骨損害的發(fā)病機(jī)制。

4小結(jié)

氟中毒時(shí)對(duì)軟骨細(xì)胞有嚴(yán)重的損害作用，可引起軟骨細(xì)胞的凋亡、壞死及分化異常，造成軟骨層變薄、軟骨骨化等病理改變，而軟骨損害是導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙、影響患者日常生活的主要原因。氟骨癥的發(fā)生可能與過(guò)量氟造成機(jī)體氧自由基、一氧化氮水平升高及過(guò)度激活信號(hào)通路有關(guān)。通過(guò)對(duì)氟中毒發(fā)病機(jī)制的深入探討，將對(duì)預(yù)防氟中毒的發(fā)生、發(fā)展及提高患者的生存質(zhì)量起到極其重要的作用。

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Research the Mechanism of Hedgehog Signaling Pathway in Chondrocyte Damage in Endemic FluorosisZHUZhi-jian,TAOXin,YUYan-ni.(DepartmentofPathology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China)

Abstract：Fluorine plays an irreplaceable role in the process of physiological metabolism:appropriate amount of fluoride can promote development of the nervous system and motor system,but excessive intake will cause a series of poisoning symptoms. Skeletal fluorosis is a kind of chronic joint disease,which mainly damages the limb joint cartilage,bone and bone tissues. Hedgehog(Hh) signal pathway is a classic signal pathway of embryonic development and differentiation,which plays an important role in cell differentiation and proliferation during the embryonic development.And many factors of the Hh signaling pathway have direct regulatory role on the growth of cartilage and bone.Therefore, the Hh signaling pathway may be involved in the pathogenesis of cartilage damage in fluorosis.

Key words：Endemic fluorosis； Hh signal pathway； Chondrocyte damage

收稿日期：2015-06-04修回日期：2015-06-30編輯：鄭雪

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81260419)；教育部博士點(diǎn)基金(博導(dǎo)類)(20125215110001)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.011

中圖分類號(hào)：R363.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)18-3294-03