范群艷++陳昕露++連建梅++陳玲++張怡

摘 要 為優(yōu)化燕窩唾液酸微波結(jié)合木瓜蛋白酶提取工藝，并研究燕窩對(duì)幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取微波處理時(shí)間，酶解溫度和pH三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化燕窩唾液酸的提取工藝；采用水迷宮試驗(yàn)，測(cè)試燕窩對(duì)正常幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用。確定了燕窩唾液酸微波結(jié)合木瓜蛋白酶提取的最優(yōu)工藝，工藝參數(shù)為微波時(shí)間100 s，酶解溫度60℃，pH 7，在此條件下唾液酸提取率為12.58%；水迷宮試驗(yàn)表明，燕窩唾液酸提取液灌胃組幼鼠尋找平臺(tái)平均潛伏期均縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)都增加。響應(yīng)面法優(yōu)化微波結(jié)合木瓜蛋白酶提取得到燕窩唾液酸的工藝，燕窩對(duì)幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善作用。

關(guān)鍵詞 燕窩 ；唾液酸 ；幼鼠 ；學(xué)習(xí)記憶能力

分類號(hào) TS201.4 ；R284.I

Microwave-assisted Enzymatic Hydrolysis of Birds Nest Sialic Acid

and Its Effect on Improving Intelligence of Young Rats

FAN Qunyan1） CHEN Xinlu2） LIAN Jianmei1） CHEN Ling1） ZHANG Yi2）

（1 Xiamen Seelong Food CO. LTD， Xiamen， Fujian 361101；

2 College of Food Science， Fujian Agriculture and Forestry University，

Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract The Optimized microwave-papain extraction of sialic in edible bird nest， and the effects of sialic on learning and memory in young rats were studied. On the basis of single factor experiment， the microwave processing time， enzyme temperature and pH were considered using response surface methodology； The stewed edible bird's nest and sialic acid standard group for the learning and memorizing ability of SD rats were observed by Morris water maze. It shown that microwave treatment could improve the hydrolysis rate， when the condition was microwave power 400W， microwave time 100 s， enzymolysis temperature 60℃， pH 7， the experimental sialic acid yield of （12.58±0.08）% was achieved. Through the water maze experiment， the test group rats could find the platform faster and more often， which indicated that certain dose of bird nest can enhance the abilities of learning and memory of young rats.

Keywords birds nest ； sialic acid ； young rats ； learning and memorizing abilities

燕窩是雨燕科（Apedidae）雨燕目中部分金絲燕分泌的唾液與其絨羽混合粘結(jié)所筑成的巢穴[1]。產(chǎn)于我國(guó)南部沿海一帶及越南、馬來(lái)西亞、印度尼西亞、泰國(guó)、緬甸等地。燕窩富含豐富的蛋白質(zhì)、糖類和礦物質(zhì)，其重要特征成分為唾液酸糖蛋白。唾液酸是一種神經(jīng)氨酸的衍生物，廣泛存在于多種生物組織中。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，唾液酸及其衍生物在各種生命活動(dòng)調(diào)節(jié)中起重要作用[2-5]。Morgan等[6]研究表明，隨著攝入唾液酸含量的增加，動(dòng)物幼崽完成迷宮學(xué)習(xí)任務(wù)的能力提高，說(shuō)明攝入外源唾液酸對(duì)動(dòng)物幼崽發(fā)育起到重要作用。

木瓜蛋白酶提取燕窩中的唾液酸，能提高唾液酸的溶出量，提高提取率；但酶解反應(yīng)所需的時(shí)間較長(zhǎng)，速度較慢[7]。微波提取技術(shù)作為一種近年來(lái)較常用的技術(shù)，具有提取時(shí)間短、選擇性高、耗能低、提取條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[8-10]。因此本研究采用微波輔助酶法提取燕窩中唾液酸，分析各因素對(duì)燕窩唾液酸提取效果的影響，并通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化其工藝參數(shù)，為燕窩唾液酸的綜合利用奠定基礎(chǔ)。同時(shí)以唾液酸純品和益于腦發(fā)育物質(zhì)——腦復(fù)康為對(duì)照，研究燕窩唾液酸提取液對(duì)幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，為功能性燕窩新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

燕窩，原產(chǎn)地馬來(lái)西亞，廈門(mén)市絲濃食品有限公司提供；腦復(fù)康（吡拉西坦）片，購(gòu)于天津金世制藥有限公司；唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司出品；其他試劑均為分析純；木瓜蛋白酶（酶活力為2.5×106 μ/g），北京化學(xué)試劑公司；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，昆明種幼鼠（清潔級(jí)），雄雌各半，體重10～12 g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 儀器endprint

PL602-L電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）、DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)有限公司設(shè)備有限公司）、L530離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、C21-SH2126美的電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司）、MRO-DF6-H微波爐（日本日立電器有限公司）、DS-200型電動(dòng)高速組織搗碎機(jī)（江蘇江陰市科研器械廠）、Morris水迷宮操作系統(tǒng)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 唾液酸提取工藝流程

燕窩粉末→酶處理→微波處理→滅酶→離心取上清液→燕窩唾液酸。

操作要點(diǎn)（1）燕窩粉末的制備：稱取一定量的燕窩，研磨過(guò)40目篩備用；（2）酶處理：稱取一定量燕窩粉末，按燕窩∶水（m/m）為1∶20的比例加入蒸餾水，加入4%木瓜蛋白酶（以燕窩粉末計(jì)），在一定的酶解溫度、時(shí)間和pH的條件下進(jìn)行酶解。（3）微波處理：將酶解好的混合液在一定功率、時(shí)間下進(jìn)行微波提取。（4）滅酶：將微波處理后的混合液在沸水浴中滅酶10 min。（5）離心：在3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液即為燕窩唾液酸提取液。

1.2.2 唾液酸提取率

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[11]

稱取一定量的唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制成0、5、10、20、50、100、200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)唾液酸溶液，吸取1 mL，加入冰醋酸和酸性茚三酮試劑各1 mL，在沸水浴中煮沸保溫10 min，冷卻至室溫后，于470 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以唾液酸濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，A=0.005 1 C+0.020 4（R2=0.998）。

（2）提取率計(jì)算

取燕窩唾液酸提取液同1.2.1操作，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中的唾液酸濃度，并計(jì)算提取率，計(jì)算公式為：

x=×100

式中，x：樣品中唾液酸提取率，%；

c：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的唾液酸濃度，μg/mL；

50：提取后定容體積，mL；

m：樣品的質(zhì)量，g；

0.134 7：1 g標(biāo)準(zhǔn)燕窩中唾液酸的含量，g。

1.2.3 唾液酸提取液對(duì)幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

（1）動(dòng)物分組與給藥

SD幼鼠隨機(jī)分組，每組10只（雌雄各半）。設(shè)空白對(duì)照組（0.9%生理鹽水），唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品組（0.50 mg/mL），燕窩唾液酸組（高70 mg/mL、中30 mg/mL、低10 mg/mL），腦復(fù)康組（225 mg/mL），每日灌胃量為0.2 mL，連續(xù)灌胃21 d，自由飲水和進(jìn)食。

（2）水迷宮實(shí)驗(yàn)[12]

末次給藥后，進(jìn)行水迷宮行為測(cè)定。實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容包括隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)、空間搜索實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練。通過(guò)記錄與分析幼鼠平均找到逃避潛伏期、運(yùn)動(dòng)軌跡等，判斷幼鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力是否提高。

平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練5 d，每天4次，每次間隔5 min。以尋找水下平臺(tái)潛伏期（s）作為判斷幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)，如果幼鼠在1 min內(nèi)找到平臺(tái)，讓其在平臺(tái)上停留10 s；如果未找到安全平臺(tái)，則將幼鼠引至安全平臺(tái)并在平臺(tái)停留10 s，逃避潛伏期記為60 s。

空間搜索實(shí)驗(yàn)：5 d訓(xùn)練結(jié)束后，在第6 天撤去安全平臺(tái)，將幼鼠釋放入水中，游泳60 s，測(cè)量60 s內(nèi)幼鼠穿越原平臺(tái)放置處的次數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶解溫度對(duì)唾液酸提取率的影響

在一定的酶解溫度條件下，pH為8，酶解2.5 h，燕窩唾液酸提取率均隨著酶解溫度的增大而先上升后下降，最適酶解溫度為55℃（圖1）。溫度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響由于其復(fù)雜性，還未完全清楚，一般來(lái)說(shuō)，溫度是影響酶活性的主要原因，而溫度促使酶蛋白變性是可隨時(shí)間累加的[1]。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)唾液酸提取率的影響

在酶解溫度為45℃，pH為8的條件下進(jìn)行酶解。結(jié)果由圖2可知，燕窩經(jīng)酶解2 h后，提取率達(dá)8.7%，之后唾液酸提取率趨于穩(wěn)定。

2.1.3 pH對(duì)唾液酸提取率的影響

在酶解溫度為45℃，一定pH條件下酶解2.5 h，酶解最佳pH值均為7（圖3）。燕窩唾液酸提取率隨pH值的升高而升高，當(dāng)pH值為7時(shí)最高，隨后下降。pH值影響酶催化速度，pH不同，酶及作用底物所帶電荷不同，酶的立體構(gòu)象以及酶與底物的親和力不同，催化速度也就不同[14-15]。

2.1.4 微波功率和微波時(shí)間對(duì)唾液酸提取率的影響

通過(guò)均勻試驗(yàn)研究微波功率及微波時(shí)間對(duì)燕窩唾液酸提取率的影響，由表1可知，微波功率400 W，微波時(shí)間60 s時(shí)，唾液酸提取率最高。這是因?yàn)槲⒉üβ试礁?、作用時(shí)間越長(zhǎng)，則熱效應(yīng)越明顯，而溫度高蛋白酶易失活。微波可以改善酶催化的反應(yīng)體系，一方面可能改變了酶的活性中心立體結(jié)構(gòu)，另一方面增加了底物與酶基團(tuán)的接觸，從而提高酶催化反應(yīng)速度[16]。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

選用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取微波處理時(shí)間（A）、酶解溫度（B）及pH值（C）3個(gè)影響因素，以唾液酸提取率為響應(yīng)值Y，采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析（表2），得到回歸方程：

Y=10.56+0.039×A+0.089×B-0.045×C-0.45×A×B-0.073×A×C-0.25×B×C-0.20×A2-0.20×B2-0.19×C2。endprint

由方差分析結(jié)果（表3）可知，微波處理時(shí)間、酶解溫度及pH在燕窩唾液酸的提取過(guò)程中有較顯著影響，失擬項(xiàng)不顯著，相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.986 8。綜上所述，該模型可為分析和預(yù)測(cè)燕窩唾液酸的提取提供一個(gè)合適的模型。

以微波處理時(shí)間（A）、酶解溫度（B）及pH值（C）這3個(gè)影響提取率的因素兩兩組合為自變量，以燕窩唾液酸提取率為相應(yīng)指標(biāo)繪制響應(yīng)面及等高線圖，用來(lái)評(píng)價(jià)各因素兩兩組合對(duì)提取率的交互影響作用，如圖4～6。

由等高線圖可以看出，酶解溫度、微波時(shí)間和pH兩兩交互作用極顯著。由響應(yīng)面圖可以看出，當(dāng)酶解溫度一定時(shí)，唾液酸提取率隨微波時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH一定時(shí)，唾液酸提取率隨微波時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH一定時(shí)，唾液酸的提取率隨溫度的增高而增大，隨著pH的逐漸增加，唾液酸提取率呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢(shì)。

響應(yīng)面分析法得到燕窩唾液酸提取率最佳工藝條件為微波時(shí)間100.19 s，酶解溫度59.98℃，pH 6.95，預(yù)測(cè)提取率為12.61%。為了進(jìn)一步證實(shí)該模型的模擬結(jié)果，在酶解溫度為60℃、pH為7.0的條件下微波處理100 s，平行提取3次，測(cè)得平均值為12.58%，預(yù)測(cè)值接近真實(shí)值，有很好的擬合性，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可靠性。

2.3 燕窩唾液酸提取液對(duì)改善幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用

Moms水迷宮試驗(yàn)現(xiàn)是檢測(cè)動(dòng)物記憶水平的重要工具，是Richard Morris在1981發(fā)明的。國(guó)內(nèi)外學(xué)者將益智類藥食品灌胃大小鼠等，以水迷宮試驗(yàn)評(píng)價(jià)是否有助于動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶能力[17-19]。由表4可知，在定位航行實(shí)驗(yàn)中，各個(gè)組別的幼鼠隨著尋找平臺(tái)試驗(yàn)次數(shù)的增加，平均潛伏期都縮短，且燕窩唾液酸各劑量組幼鼠尋找平臺(tái)的平均潛伏期均比對(duì)照組短。其中，燕窩唾液酸中劑量組的平均潛伏期分別比燕窩低、高組短，略低于唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品組，與腦復(fù)康的作用相當(dāng)。觀察第6天的空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于對(duì)照組，各試驗(yàn)組穿越平臺(tái)次數(shù)均有所增加，燕窩唾液酸中劑量組在燕窩唾液酸組中穿越平臺(tái)次數(shù)中最高，次數(shù)略低于唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品組和腦復(fù)康組。腦復(fù)康作為藥品在醫(yī)學(xué)中已有較深入的研究，研究證明其有抗老年癡呆、改善學(xué)習(xí)記憶功能的作用[20]。由此說(shuō)明燕窩唾液酸提取液具有一定的改善小鼠學(xué)習(xí)記憶的功效。

3 結(jié)論與討論

采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了燕窩唾液酸的提取工藝，其最佳條件為：微波時(shí)間100 s，酶解溫度60℃，pH 7.0，該工藝條件下燕窩唾液酸的提取率為12.58%。

學(xué)習(xí)與記憶是動(dòng)物和人類生存中重要的腦功能，人類區(qū)別動(dòng)物的智力活動(dòng)也是基于此。學(xué)習(xí)與記憶是一個(gè)復(fù)雜的研究領(lǐng)域，涉及多門(mén)學(xué)科，本試驗(yàn)采用幼鼠進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，初步證明了燕窩唾液酸提取液對(duì)于動(dòng)物具有增長(zhǎng)學(xué)習(xí)記憶能力的作用，但其影響機(jī)理需今后進(jìn)一步研究。

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